肝細胞癌患者外周血CD100的表達變化及其對T淋巴細胞的功能調控

范慧娟， 宋 淳

空軍軍醫大學第二附屬醫院 消化內科， 西安 710038

肝細胞癌(HCC)發病率在我國居所有惡性腫瘤第5位，死亡率居第2位[1]。免疫因素參與了HCC的發病過程，HCC發生發展過程中可誘導機體T淋巴細胞功能衰竭，免疫細胞喪失有效抗腫瘤活性，處于失能狀態，造成HCC疾病進展[2]。但有關HCC患者T淋巴細胞失能及功能調控的機制尚未完全闡明。CD100是免疫信號素家族成員之一，又稱為Sema4D，在機體內具有兩種生物學活性形式，即：可溶型CD100(soluble CD100, sCD100)和膜型CD100(membrane-bound CD100, mCD100)，在慢性肝炎病毒感染、慢加急性肝衰竭、惡性腫瘤等疾病過程中存在sCD100和mCD100失衡，造成機體免疫紊亂[3-6]。但有關CD100在HCC中的表達變化及其對T淋巴細胞功能的調控作用尚未見相關報道。因此，本研究檢測HCC患者外周血sCD100和T淋巴細胞表面mCD100水平，觀察重組人CD100體外刺激對HCC患者T淋巴細胞功能的影響，初步探討CD100在HCC發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 前瞻性選擇2020年4月—2021年7月在本院就診的57例HCC患者作為研究對象。入組標準：(1)年齡≥18歲且<70歲；(2)符合《原發性肝癌診療規范(2019年版)》[7]中提出的診斷標準；(3)采集血液標本前未接受手術、介入、靶向、免疫等治療。排除標準：(1)合并人獲得性免疫缺陷病毒感染；(2)合并自身免疫性疾病；(3)合并心臟、肺臟、腎臟、中樞神經系統等重要臟器功能衰竭；(4)合并其他惡性腫瘤；(5)妊娠期或哺乳期婦女。選擇同時期在本院健康查體的22例健康人作為對照。

1.2 主要試劑和儀器 淋巴細胞分離液、佛波酯、伊烏諾霉素(美國Sigma公司)；CD100酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢華美公司)；重組人CD100(北京ACRO公司)；小鼠抗人CD3-PE Cy7(克隆SK7)、小鼠抗人CD4-FITC(克隆RPA-T4)、小鼠抗人CD8-APC Cy7(克隆SK1)、小鼠抗人CD100-Alexa Fluor 647(克隆A8)、小鼠抗人干擾素γ(IFNγ)(克隆4S.B3)、小鼠抗人白細胞介素-17A(IL-17A)-PerCP Cy5.5(克隆N49-653)、小鼠抗人IL-22-PE(克隆MH22B2)、BD GolgiStop蛋白轉運抑制劑、BD Cytofix固定液、BD Perm/Wash破膜洗滌緩沖液(美國BD Pharmingen公司)；細胞增殖檢測Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(武漢碧云天公司)；人穿孔素酶聯斑點吸附試驗(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)試劑盒和人顆粒酶B ELISPOT試劑盒(美國Abcam公司)；MagCellect人CD8+T淋巴細胞純化試劑盒(美國R&D公司)；乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒(武漢碧云天公司)；微孔讀板儀(美國伯樂公司)；FACS AriaⅡ流式細胞儀(美國BD Bioscience公司)；ELISPOT讀板儀(德國AID公司)。多肽由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血漿和外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)分離 清晨空腹采集10 mL抗凝外周血，于1000 r/min離心10 min后收集上層血漿，凍存于-80 ℃。使用淋巴細胞分離液、采用密度梯度離心法分離PBMC，凍存于液氮。

1.3.2 ELISA法檢測sCD100 使用CD100 ELISA檢測試劑盒對血漿中sCD100水平進行檢測。向檢測孔中加入100 μL標準品和血漿樣本，于37 ℃孵育2 h，棄液體后直接加入100 μL生物素標記工作抗體，于37 ℃孵育1 h，棄液體洗板3次后加入100 μL辣根過氧化物酶標記親和素，于37 ℃孵育1 h，棄液體洗板5次后加入90 μL TMB底物，于37 ℃避光孵育30 min，加入50 μL終止液，輕輕混勻后在450 nm波長處讀取吸光度，根據標準品吸光度繪制標準曲線，計算血漿sCD100濃度。

1.3.3 PBMC刺激培養 復蘇PBMC，使用RPMI1640+10%胎牛血清于37 ℃、5%CO2條件下培養，加入重組人CD100(終濃度：2 μg/mL)[5-6]刺激培養48 h。

1.3.4 流式細胞術 所有HCC患者、對照者未刺激的PBMC直接轉入FACS流式檢測管中，洗滌后加入小鼠抗人CD3-PE Cy7、小鼠抗人CD4-FITC、小鼠抗人CD8-APC Cy7、小鼠抗人CD100-Alexa Fluor 647各5 μL，于4 ℃避光孵育30 min，洗滌后使用流式細胞儀進行檢測。接受重組人CD100刺激的PBMC加入佛波酯(終濃度：50 ng/mL)、伊烏諾霉素(終濃度：1 μg/mL)，同時加入4 μL蛋白轉運抑制劑，于37 ℃、5%CO2條件下培養5 h，將細胞轉入FACS流式檢測管中，加入100 μL固定液固定細胞后，使用250 μL破膜洗滌緩沖液對細胞進行破膜，洗滌后加入小鼠抗人CD3-PE Cy7、小鼠抗人CD4-FITC、小鼠抗人CD8-APC Cy7、小鼠抗人IFNγ、小鼠抗人IL-17A-PerCP Cy5.5、小鼠抗人IL-22-PE各5 μL，于4 ℃避光孵育30 min，洗滌后使用流式細胞儀進行檢測。

1.3.5 細胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒對細胞增殖檢測進行檢測。在培養的最后4 h，加入10% CCK-8工作液，培養結束后在450 nm波長處讀取吸光度，根據已知細胞數量的標準品吸光度繪制標準曲線，計算樣本細胞數量。

1.3.6 ELISPOT檢測 選擇11例HLA-A02限制性HCC患者的PBMC，重組人CD100刺激后加入預包被的PVDF膜ELISPOT平板中，加入甲胎蛋白(AFP)HLA-A02限制性多肽(序列：FMNKFIYEI；終濃度：10 μg/mL)[8]，于37 ℃、5%CO2條件下培養48 h，棄液體洗板3次后加入100 μL鏈霉親和素堿性磷酸酶耦合物，室溫孵育1 h，棄液體洗板3次后加入100 μL BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑，室溫孵育15 min，洗板3次后使用ELISPOT讀板儀讀板。

1.3.7 CD8+T淋巴細胞純化、刺激以及與HepG2細胞的共培養 選擇7例HLA-A02限制性HCC患者的PBMC，取107個PBMC，離心后使用緩沖液重懸，加入100 μL MagCellect人CD8+T淋巴細胞生物素標記抗體雞尾酒，混勻后4 ℃孵育15 min，加入200 μL鐵磁流體標記的鏈霉親和素，混勻后4 ℃孵育15 min，使用緩沖液將細胞懸液總體積調整至2 mL，將試管置于MagCellect磁力架上，室溫孵育6 min，小心吸出未沉淀的細胞懸液，其中含有純化的CD8+T淋巴細胞。取105個純化的CD8+T淋巴細胞，加入AFP HLA-A02限制性多肽(10 μg/mL)和重組人CD100(2 μg/mL)刺激培養24 h，然后加入5×105個HepG2細胞(亦為HLA-A02限制性)共培養24 h后收集上清。

1.3.8 HepG2細胞死亡檢測 收集100 μL培養上清加入96孔板中，加入100 μL LDH細胞毒性檢測反應液，室溫孵育30 min，在490 nm波長處讀取吸光度。低對照為HepG2細胞培養上清的吸光度，高對照為細胞裂解液處理的HepG2細胞培養上清的吸光度，細胞死亡百分比=(檢測樣本-低對照)/(高對照-低對照)×100%。

2 結果

2.1 一般資料 HCC組57例，既往有乙型肝炎48例，丙型肝炎2例，酒精性肝病7例，42例患者有肝硬化病史。對照組和HCC組在性別比例和年齡間的差異無統計學意義(P值均>0.05)，HCC組AFP水平顯著高于對照組(P<0.001)(表1)。

表1 患者的一般臨床資料

2.2 HCC患者外周血CD100表達變化 HCC組血漿sCD100水平低于對照組(P<0.001)。對照組和HCC組患者CD3+CD4+T淋巴細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞表面mCD100表達典型流式檢測分析見圖1。HCC組外周血CD4+T淋巴細胞中CD100陽性細胞比例、mCD100平均熒光強度(mean fluorescent intensity, MFI)均高于對照組(P值均<0.05)。HCC組外周血CD8+T淋巴細胞中CD100陽性細胞比例、mCD100 MFI亦均高于對照組(P值均<0.05)(表2)。

表2 對照組和HCC組中血漿sCD100、CD4+和CD8+T淋巴細胞中mCD100表達比較

圖1 對照組和HCC組CD4+和CD8+T淋巴細胞表面mCD100表達流式細胞檢測

2.3 重組人CD100對HCC患者PBMC細胞增殖和T淋巴細胞比例的影響 取27例HCC患者的PBMC(5×105個)使用重組人CD100刺激培養，PBMC增殖數量在經CD100刺激和無CD100刺激之間差異無統計學意義(P=0.399)，CD4+和CD8+T淋巴細胞占CD3+T淋巴細胞的比例在經CD100刺激和無CD100刺激之間差異亦無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 重組人CD100對HCC患者PBMC細胞增殖和T淋巴細胞比例的影響

2.4 重組人CD100對HCC患者輔助性T淋巴細胞(Th)和殺傷性T淋巴細胞(Tc)的影響 HCC患者PBMC無CD100刺激和經CD100刺激后CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞分泌IFNγ、IL-17A、IL-22的典型流式分析圖分別見圖2、3。HCC患者PBMC經CD100刺激后，輔助性CD4+T淋巴細胞中，CD4+IFNγ+Th1細胞、CD4+IL-17A+Th17細胞、CD4+IL-22+Th22細胞比例均高于無CD100刺激(P值均<0.05)。經CD100刺激后，殺傷性CD8+T淋巴細胞中，CD8+IFNγ+Tc1細胞比例高于無CD100刺激(P<0.001)，但CD8+IL-17A+Tc17細胞和CD8+IL-22+Tc22細胞比例在經CD100刺激和無CD100刺激之間差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表4)。

表4 重組人CD100對HCC患者PBMC中Th細胞和Tc細胞亞群的影響

圖2 HCC患者PBMC無CD100刺激和經CD100刺激后輔助性CD4+T淋巴細胞亞群的檢測

2.5 重組人CD100對HCC患者AFP特異性CD8+T淋巴細胞分泌穿孔素、顆粒酶B以及殺傷功能的影響 11例HLA-A02限制性HCC患者的PBMC經CD100刺激后，AFP特異性CD8+T淋巴細胞分泌穿孔素和顆粒酶B的細胞數量均高于無CD100刺激(P值均<0.05)(表5)。7例HLA-A02限制性HCC患者CD8+T淋巴細胞經CD100刺激后，AFP特異性CD8+T淋巴細胞誘導HepG2細胞死亡的比例亦高于無CD100刺激(16.40%±4.52% vs 11.81%±2.84%，t=2.272，P=0.042)。

圖3 HCC患者PBMC無CD100刺激和經CD100刺激后殺傷性CD8+T淋巴細胞亞群的檢測

表5 重組人CD100對HCC患者AFP特異性CD8+T淋巴細胞分泌穿孔素和顆粒酶B的影響

3 討論

宮頸癌和卵巢癌患者腫瘤組織中CD100表達水平升高[9-10]，并可誘導腫瘤浸潤單核細胞向M2型巨噬細胞分化[10]，但腫瘤組織中CD100為總體CD100，包括免疫細胞和腫瘤實質細胞中的CD100，腫瘤組織中的CD100可通過促進腫瘤細胞增殖和遷移、誘導骨轉移、腫瘤血管生成擬態，導致腫瘤疾病進展，因此，腫瘤組織CD100升高與疾病預后不良密切相關[11-12]。而本報道中所關注的是HCC患者中兩種活性形式的CD100水平，細胞表面的mCD100活化后，細胞外基序脫落后形成的sCD100仍有生物學活性，可誘導傳統抗原提呈細胞成熟，并直接調控免疫細胞功能[3-6]。急性病毒感染性疾病(如：急性乙型肝炎、腎綜合征出血熱)和自身免疫性疾病(如：類風濕性關節炎)患者外周血sCD100水平升高，但免疫細胞表面mCD100水平降低[3,13-14]，這提示在機體免疫活化狀態下，mCD100從免疫細胞表面脫落形成的sCD100具有較強的免疫調節作用。本研究發現，HCC患者中亦存在CD100表達失衡，表現為外周血sCD100水平降低，T淋巴細胞表面mCD100水平升高，這與既往在機體免疫抑制狀態下(如：慢性病毒感染[3-4]、非小細胞肺癌[6]、膿毒性心肌病[15])的表達譜基本一致。但在非小細胞肺癌患者中，mCD100僅在CD8+T淋巴細胞中升高，但在CD4+T淋巴細胞中的表達與對照組無明顯差異[6]，而本研究發現，HCC患者CD4+和CD8+T淋巴細胞中mCD100水平均顯著升高，提示HCC患者T淋巴細胞中mCD100脫落明顯受到抑制，造成HCC患者sCD100水平降低。因此，HCC患者中sCD100水平降低可能是由于mCD100從細胞表面脫落不足引起的，進一步導致免疫細胞功能障礙，誘導機體免疫耐受，促進HCC疾病進展。

惡性腫瘤和慢性病毒感染中存在T淋巴細胞功能衰竭[16]，以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫療法可打破機體免疫耐受，恢復T淋巴細胞活性，為惡性腫瘤患者的治療提供了有效方法，因此，重塑腫瘤患者T淋巴細胞功能活性是目前腫瘤治療研究的熱點之一[17]。CD100對T淋巴細胞具有免疫調控作用[15]。本研究對外源性CD100調控HCC患者T淋巴細胞的功能活性進行了研究。第一、外源性CD100并未影響HCC患者PBMC增殖和不同T淋巴細胞亞群的比例。這提示CD100可能不通過改變T淋巴細胞數量調控其功能。第二、外源性CD100增加Th1、Th17、Th22細胞比例。這與在膿毒性心肌病、腎小球腎炎中所發現的CD100增強CD4+T淋巴細胞功能的結果一致[15,18]。因此，sCD100表達降低可能抑制了HCC患者CD4+T淋巴細胞免疫應答。第三、CD8+T淋巴細胞是發揮腫瘤殺傷作用的主要免疫細胞之一[19-20]，主要通過兩種不同的途徑發揮抗腫瘤活性，一方面，CD8+T淋巴細胞可分泌細胞因子，通過非特異性殺傷作用誘導腫瘤細胞死亡；另一方面，特異性CD8+T淋巴細胞可通過抗原識別介導腫瘤細胞殺傷，這一過程主要通過分泌穿孔素、顆粒酶B等毒性分子并依賴細胞間直接接觸發揮作用[19-20]。外源性CD100可增加非特異性Tc1細胞比例，但對非特異性Tc17和Tc22細胞并未顯著影響，提示CD100可促進非特異性CD8+T淋巴細胞分泌IFNγ，但對其他細胞因子分泌可能無明顯影響。外源性CD100還可增加AFP特異性CD8+T淋巴細胞分泌穿孔素和顆粒酶B的能力，外源性CD100刺激后AFP特異性CD8+T淋巴細胞對HepG2細胞的體外殺傷功能增強，提示CD100可促進特異性CD8+T淋巴細胞殺傷功能。這與在非小細胞肺癌、急性心肌梗死中CD100可增強CD8+T淋巴細胞殺傷功能的結果基本一致[6,21]，這說明sCD100表達降低可能不足以維持HCC患者非特異性和特異性CD8+T淋巴細胞功能，造成細胞失能。但CD100對HCC特異性T淋巴細胞功能調控的機制還有待體內實驗進一步研究。

總之，HCC患者中存在sCD100和T淋巴細胞中mCD100表達失衡，sCD100水平降低可能無法維持T淋巴細胞功能活性，造成HCC免疫耐受。CD100可能成為HCC治療新的靶點。

倫理學聲明：本研究方案于2020年4月16日經空軍軍醫大學第二附屬醫院倫理委員會批準，批號：TDLL-202002-038，所有患者或家屬行告知并簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：范慧娟負責實驗操作，數據分析和論文撰寫；宋淳負責課題設計、指導論文撰寫并最后定稿。