內源性脂質介質在肝衰竭中的應用及潛在價值

顏耿杰， 林 鏞， 蘇會吉， 陳含笑， 班少群， 韋艾凌,， 毛德文， 龍富立

1 廣西中醫藥大學 研究生院， 南寧 530200； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病二區， 南寧 530023

脂質不僅作為細胞膜的重要成分，也是關鍵的信號傳導介質，參與多種代謝功能。同時作為代謝和免疫系統中可溶性介質網絡的一部分，不僅是一種高效的能量底物，而且還可以作為關鍵的抗炎分子。內源性脂質已被證實是炎癥過程中的關鍵介質，參與炎癥的啟動、維持和消退[1]。肝衰竭是一種嚴重且復雜的肝病癥候群，臨床上常見的有急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)和慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)，其特征在于嚴重的全身炎癥和免疫功能障礙，病死率極高。異常和不受控制的炎癥會導致免疫應答的紊亂，其特征是促炎抗炎不平衡，這反過來又會破壞組織穩態并導致急性損害，加速疾病進展。越來越多的證據表明內源性脂質介質中的類二十烷酸和專門的促分解脂質介質(specialized pro-resolving lipid mediators,SPM)與肝衰竭全身炎癥免疫之間存在關聯，其在肝衰竭中的治療潛力也備受關注。

1 內源性脂質介質與炎癥

1.1 類二十烷酸 類二十烷酸主要來自花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，由120多種化合物組成，它們參與體內的炎癥過程，并被認為是炎癥小體活化的直接結果[2]。所有類二十烷酸的合成都是在胞質磷脂酶A2 (cytosolic phospholipase A2，cPLA2) 催化作用下開始的，cPLA2是一種廣泛分布的酯酶，并且依賴膜甘油磷脂sn-2位置的AA催化多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的水解[3]。當受體-配體相互作用引起細胞內鈣的變化時，類二十烷酸開始合成，cPLA2被募集到細胞膜上，促進磷脂中 AA 的釋放，進而進入三個主要的生物合成途徑。(1)環加氧酶(cyclooxygenase，COX)途徑：COX-1和COX-2都參與將AA轉化為前列腺素類化合物[即前列腺素(prostaglandin，PG)、前列環素和血栓素]的主要前體——PGH2，PGH2隨后通過組織特異性異構酶轉化為下游前列腺素類化合物，最終產生前列腺素類化合物中的一種或兩種[4]。(2)脂氧合酶 (lipoxygenase, LOX)途徑：LOX促進AA轉化為多烯，如白三烯(leukotriene，LT)和脂氧素(lipoxin，LX)，以及轉化為羥基花生四烯酸或氫過氧化二十碳四烯酸[5]。(3)細胞色素P450通路：通過細胞色素P450 環氧化酶(CYP450)轉化為AA的其他羥基化物(例如20-羥基花生四烯酸)或通過CYP2C和CYP2J將AA轉化為具有抗炎作用的環氧二十碳三烯酸[6]。這3種途徑產生類脂類信號分子，在炎癥、疼痛和免疫功能等過程中發揮作用，并且是急性和慢性炎癥反應中的關鍵介質[7]。研究[4,8-9]表明，PG[特別是PGE2和前列環素I 2(PGI2)]信號傳導推動了急性和慢性炎癥之間的轉換，目前發現其轉換機制主要是：(1)增強促炎細胞因子釋放級聯反應；(2)加強對病原體和損傷相關分子模式(PAMP和DAMP)的先天免疫反應；(3)通過與趨化因子協同作用，募集與慢性炎癥相關的免疫細胞(例如巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞)；(4)激活輔助性T淋巴細胞(Th)的特定促炎亞群，例如Th1和Th17；(5)增加由細胞因子誘導的促炎基因。

1.2 促分解脂質介質(SPM) SPM是一個相對較新的內源性脂質家族，與類二十烷酸類似，SPM 是由PUFA合成的，PUFA通過PLA2的作用與膜磷脂分離，然后被引導到不同的生物合成途徑，在急性炎癥期間通過巨噬細胞、中性粒細胞、血小板和缺氧內皮細胞的協同作用產生，以抵消炎癥信號，有利于炎癥的消退[4]。該家族目前已發展到包括來自二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的二羥基化和三羥基化脂肪酸， EPA、DPA和DHA都是通過與類二十烷酸相同的途徑(COX、LOX和CYP途徑)代謝，最終導致消退素(resolvins)、巨噬素(maresins)、保護素(protectins)和脂氧素(lipoxins)的合成[10]。據報道[11-13]，maresins可以減輕疼痛并有利于組織再生，resolvins促進單核細胞/巨噬細胞的吞噬作用以清除體內病原微生物，protectins已被證明在大腦和視網膜中釋放，具有維持細胞穩態和保護神經的作用。SPM由單核細胞/巨噬細胞和粒細胞在急性炎癥期產生，在此期間，脂質信號的產生發生了巨大變化，隨著類二十烷酸停止產生，SPM開始在發炎部位積累，促進巨噬細胞的分化，并誘導中性粒細胞凋亡，同時促進巨噬細胞吞噬死亡的中性粒細胞和組織碎片。這些脂質還通過干擾促炎T淋巴細胞(例如Th1和Th17)的激活和分化來避免慢性炎癥，同時增強調節性T淋巴細胞 (Treg) 的免疫調節功能[14-15]。此外，SPM還通過限制幾乎所有T淋巴細胞亞群的持續激活和自身反應來預防慢性炎癥和自身免疫[16]。

2 類二十烷酸在肝衰竭中的應用

2.1 類二十烷酸與ALF ALF是由病毒、藥物毒性、缺血等因素誘發的急性肝損傷，導致DAMP的釋放、炎癥小體激活和促炎細胞因子及趨化因子的分泌，進而發生線粒體功能障礙導致活性氧(ROS)的釋放，其結果是因肝細胞大量壞死、肝再生功能缺陷進而增強巨噬細胞活化，并通過吞噬作用殺死細菌、分泌有利于白細胞募集和組織浸潤的促炎信號進而激活全身免疫。在對乙酰氨基酚(APAP)誘導的小鼠肝損傷模型中，肝臟AA和COX表達與轉氨酶相關，并且在使用COX-2抑制劑后肝損傷得到改善[17]。同樣COX-2抑制劑能夠改善缺血再灌注(IR)誘導的急性肝損傷，表現為血清ALT降低以及組織病理學評分的改善[18]。另外，COX-2在肝細胞中的轉基因表達加速了脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)誘導的ALF[19]。這些結果表明了COX-2衍生的前列腺素類化合物在肝損傷中的潛在作用。PGI2起初作為一種有效的血管擴張劑和血小板聚集抑制劑，但除了其血管和抗血栓作用外，PGI2還具有抗炎特性。Misawa等[20]發現貝前列素(PGI2類似物)在LPS/D-GalN誘導的ALF小鼠模型中具有保護作用，能夠增加肝血流量和減少促炎細胞因子。PGE2通常是一種重要的促炎介質，但也被認為是一種可以抑制免疫反應的消炎分子，PGE2已被證明能抑制Th1分化、B淋巴細胞功能、T淋巴細胞活化和過敏反應，還可通過影響中性粒細胞等天然免疫細胞的募集進而發揮抗炎作用[21]。早期研究[22-23]發現，PGE2通過wnt信號傳導與N-乙酰半胱氨酸(NAC)協同作用，降低了APAP相關毒性并改善了APAP誘導的ALF；前列腺素E合成酶2(mPGES-2)作為PGE2的合成酶之一，通過調節谷胱甘肽(GSH)和APAP-半胱氨酸加合物水平在改善APAP誘導的肝損傷中起著關鍵作用。另外，在IR誘導的急性肝損傷中，前列腺素E2合成酶(mPGES-1)通過增強mPGES-1/PGE2/EP4途徑積累促炎巨噬細胞使肝損傷惡化并延遲肝臟修復，突出了PGE2可能的疾病特異性作用，而抑制mPGES-1為IR的肝臟保護和修復提供了潛在的治療方法[24]。最近的一項研究[25]發現，間充質干細胞分泌的PGE2抑制肝巨噬細胞中的TAK1信號傳導和NLRP3炎癥小體活化，同時誘導M2巨噬細胞分泌抗炎細胞因子(IL-10)，并通過激活巨噬細胞中的STAT6和mTOR信號傳導途徑來促進炎癥消退和減輕肝損傷，最終抑制LPS/D-GalN誘導的肝臟炎癥反應和肝細胞凋亡，改善ALF的結局。

關于LOX途徑的代謝物，LT已被證明可以在內毒素血癥期間增強對器官的損傷。此外，白三烯B4(LTB4)是白細胞的化學引誘劑，在炎癥和免疫性疾病的發病機制中起關鍵作用，而5-LOX在肝臟中的表達僅限于巨噬細胞，因此，導致LT產生的5-LOX途徑是巨噬細胞中主要的促炎途徑，對于ALF的進展至關重要[26]。有證據[27]報道了5-LOX抑制劑顯著緩解了LPS/D-GalN誘導的ALF，肝臟中LTB4和單核巨噬細胞抗原-1陽性細胞減少，表明對巨噬細胞活化的具有抑制作用。Kupffer細胞是肝臟的常駐巨噬細胞，與肝損傷有廣泛聯系，其活化并釋放的促炎介質(如細胞因子TNFα、IL-1和IL-6、ROS以及類二十烷酸)刺激了肝臟的炎癥和纖維化，而5-LOX及其輔助蛋白5-LOX激活蛋白(FLAP)對于Kupffer細胞的存活至關重要，并且FLAP抑制劑可通過消耗Kupffer細胞并降低肝臟中的LTB4和半胱氨酸白三烯(CysLT)的表達進而緩解肝損傷[28]。綜上所述，類二十烷酸途徑已被證明在ALF中具有雙重作用，通過調節肝細胞死亡和先天免疫細胞表型來促炎和抗炎。

2.2 類二十烷酸與ACLF ACLF在慢性肝病基礎上因飲酒、服用對肝臟有害的藥物、感染等誘發，促使細菌易位增加和炎癥介質的廣泛產生，其結果是PAMP和DAMP的釋放，導致強烈的全身炎癥，這種過度炎癥狀態最終會損害免疫細胞的防御機制，使ACLF患者免疫功能低下，更容易受到繼發感染[29]。脂質組學方法揭示了類二十酸烷代謝紊亂在ACLF中的潛在意義，一項關于CANONIC隊列的研究[30]通過液相色譜聯用串聯質譜法(LC-MS/MS)確定ACLF患者與急性失代償肝硬化(AD)患者和健康對照組患者脂質介質的血漿水平，結果發現有11種脂質介質在不同疾病階段患者(ACLF或AD)與健康對照組之間存在顯著性差異，此外還存在兩種AA衍生的脂質介質LTE4和12-HHT區分了ACLF與AD患者，并且LTE4與疾病嚴重程度和短期病死率相關。在肝硬化代償期到失代償期再到ACLF的過程中，血漿人非巰基蛋白(human mercaptoalbumin，HNA)1和HNA2水平逐漸增加，HNA1具有直接的促炎作用，并已被證明可以上調ACLF患者外周血單核細胞和邊緣中性粒細胞中類二十烷酸生成酶(COX-2和mPGES-1)的表達以及炎癥性類二十烷酸(PGE2、PGF2α、TXB2和LTB4)的生成[31]。繼發感染是ACLF患者常見且嚴重的并發癥，PGE2可能在這種感染的高易感性中發揮作用。Huang等[32]進行了一項前瞻性研究發現發生繼發感染的ACLF患者的PGE2顯著高于未發生繼發感染的患者，這表明血清PGE2水平與免疫麻痹和ACLF繼發感染顯著相關。Maini等[33]探索了PGE2途徑如何調節AD/ACLF患者的單核細胞功能障礙，結果提示PGE2主要通過COX-1/mPGES-1和COX-2途徑產生，并且主要通過其EP4受體下調單核細胞TNFα和IL-6產生，并降低單核細胞HLA-DR表達從而介導單核細胞功能障礙。在HBV相關ACLF中，也觀察到循環PGE2的增加，且PGE2-EP2表達改變與ACLF的疾病嚴重程度相關，EP2拮抗劑對PGE2-EP2途徑的調節導致IFNγ、IL-6、TNFα和MCP-1的分泌增加以及單核細胞和嗜中性粒細胞的ROS產生[34]。因此，PGE2通過EP2或EP4在ACLF中的作用可能因潛在疾病而異，需要進一步探索。

3 促分解脂質介質與肝衰竭

關于SPM在ALF中的作用的研究較為有限。脂氧素是由Serhan于1984年首次發現的一組AA代謝物，與其他促炎的AA代謝物(如PG和白三烯)不同，脂氧素在炎癥緩解中發揮作用。在急性炎癥的消退階段，經歷了“脂質介質轉換”這一過程，即PG和白三烯的產生停止，脂氧素開始產生，并促進巨噬細胞清除凋亡中性粒細胞[10]。脂氧素包括脂氧素A4(LXA4)和脂氧素B4(LXB4)，兩者都在許多病理過程中起抗炎作用。據報道[35]，LXA4在LPS/D-GalN誘導的ALF大鼠模型中通過抑制Kupffer細胞中的NF-kB途徑降低血清TNFα和IL-6的水平以及抑制肝細胞凋亡進而發揮保肝作用。近年來，Resolvin D1(RvD1)作為抗炎和促消退介質，對急性肝損傷具有積極的保護作用。在四氯化碳誘導的ALF小鼠模型中，RvD1已被證實可以顯著降低血清TNFα和IL-6的水平，并上調了血紅素加氧酶-1的表達和活性，進而緩解ALF[36]。Sordi等[37]進行了一項前瞻性研究，發現創傷患者嚴重的多器官功能障礙發生率和血漿RvD1水平較健康志愿者降低，此外，他們研究了RvD1在出血性休克大鼠中誘導的多器官功能障礙綜合征中的治療作用，發現通過靜脈注射RvD1有效減輕了肝損傷，但它在正常器官中不起作用。另外在這項研究中，他們發現RvD1減少了肝臟中嗜中性粒細胞的聚集，下調了促炎因子的表達，并抑制了NF-κB途徑的激活。RvD1還可以減少肝細胞凋亡，并通過增加ALF小鼠模型中抗氧化劑GSH和超氧化物歧化酶的表達發揮抗氧化作用[36,38]。

最近，在ACLF的一項靶向脂質組學研究[30]中，發現了ACLF患者中具有促炎性質的omega-6 AA和抗炎的omega-3 EPA之間的不平衡，這表明全身性炎癥過多，無法通過促消退機制有效調控，他們還發現了EPA衍生的LXA5的血漿濃度與肝衰竭和死亡有關，而與IL-8和死亡細胞標志物呈負相關。在當下缺乏關于ACLF中SPM的研究情況下，Clària團隊[39-42]提出膿毒血癥與ACLF有許多相似之處，包括嚴重的全身炎癥、免疫功能障礙、能量產生減少和線粒體氧化功能障礙導致器官衰竭，因此或可從膿毒癥的實驗模型中為探索SPM途徑在ACLF實驗模型中的影響獲取經驗。線粒體功能障礙和產生的ROS被認為是嚴重炎癥發病機制的關鍵因素。在Gu等[43]的研究中發現，maresin 1(MaR1)抑制了ROS的產生，并且通過ALX/cAMP/ROS通路減輕了膿毒血癥小鼠模型和患者的線粒體功能障礙。同樣在Hecker等[44]的研究中證實了Resolvin E1(RvE1)可以恢復炎癥中的線粒體功能，并降低促炎細胞因子IL-6和IL-8的水平。因此，考慮到SPM參與膿毒癥炎癥及免疫反應和器官損傷的關鍵機制可能與ACLF相類似，這或許能為探索SPM途徑在ACLF動物模型及體外實驗中的作用機制提供一定的思路。目前在肝臟疾病的研究中，主要通過使用omega-3脂肪酸作為SPM的治療劑，其目的是提高其衍生SPM的生物利用度水平，并且研究主要集中在代謝性肝病中[45-46]。而在ACLF中，一項納入了90例ACLF患者的隨機對照試驗[47]評估了omega-3脂肪酸脂質乳液對免疫調節、膿毒血癥和病死率的影響，研究結果顯示omega-3脂肪酸使膿毒血癥減少了86%，顯著增加了嗜中性粒細胞和單核細胞上Toll樣受體2和Toll樣受體4的表達，然而并未引起生存率的改變。

4 總結與展望

內源性脂質介質參與了炎癥開始、維持和消退的許多細胞過程。其中，類二十烷酸和SPM已被證明與免疫細胞密切相關，并在這些過程的調節中起關鍵作用。在肝衰竭領域的研究中，主要集中在類二十烷酸代謝調節上，在COX代謝途徑中產生的前列腺素類化合物，特別是PGE2，其通過wnt信號傳導與NAC協同作用改善了APAP誘導的ALF，還可抑制肝巨噬細胞中的TAK1信號傳導和NLRP3炎癥小體活化，同時誘導M2巨噬細胞分泌抗炎細胞因子(IL-10)進而改善ALF；PGE2還通過EP2或EP4信號傳導下調IL-6、TNFα等細胞因子的生成達到拮抗肝衰竭的作用，這些信號途徑對于肝衰竭的輔助治療可能具有較大的治療潛力。目前COX-2抑制劑已被證明能夠改善肝損傷，但是各種COX-2衍生的前列腺素類化合物在肝衰竭中的具體表達及其作用機制還需進一步探索，以便將來為COX-2抑制劑的開發和準確的靶向治療途徑提供有力的科學依據。在LOX途徑中，導致LT產生的5-LOX途徑是巨噬細胞中主要的促炎途徑，對于ALF的進展至關重要；FLAP抑制劑可通過消耗Kupffer細胞并降低肝臟中的LTB4和CysLT的表達進而緩解肝損傷，因此運用5-LOX抑制劑或FLAP抑制劑對于緩解肝衰竭過度炎癥和免疫應答紊亂具有一定的潛在價值。作為一個相對較新的脂質家族，SPM在肝衰竭中的作用相對于類二十烷酸尚未得到充分的研究，LXA4和RvD1可通過抑制NF-κB途徑降低血清TNFα和IL-6的水平進而緩解ALF，RvD1還可以減少肝細胞凋亡，并通過增加GSH和超氧化物歧化酶的表達發揮抗氧化作用；目前在膿毒癥方面的研究與肝衰竭在多個病理生理機制層面具有一致性，有助于填補關于ACLF中SPM研究的空白，并為ACLF的研究思路提供更廣泛的視野。同時，SPM治療劑為阻止過度炎癥和免疫提供了新視角，它們作為免疫消退劑，不僅可以抑制炎癥，而且也可以激活促修復通路，以此達到增強修復能力，而又不損害免疫反應的目的，但是SPM在肝臟中尚無明確的作用受體。相信在今后隨著對肝衰竭研究領域的不斷拓展，通過開展脂質組學的研究并獲得更多的證據，靶向類二十烷酸和SPM相關代謝途徑和治療劑的研發及使用，發揮脂質免疫途徑在肝衰竭治療中的潛在價值，從而提高肝衰竭臨床診療水平。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：顏耿杰負責課題設計，資料分析，撰寫論文；林鏞、蘇會吉、陳含笑、班少群、龍富立參與收集數據，修改論文；韋艾凌、毛德文、龍富立負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。