中藥復方延緩腎間質纖維化研究進展*

李 蔓,陳亞楠,趙 晰△

(1.天津市北辰區中醫醫院,天津 300499;2.天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津 300381)

腎間質纖維化(RIF)是腎臟對各種類型損傷的一種非特異性反應,各種慢性和進展性腎臟疾病最終的病理結局,也是一種不可逆性的病理改變,主要的病理特征表現為大量聚集的細胞外基質沉積在腎間質和腎小管,以及各類細胞因子的釋放、浸潤、腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、細胞外基質(extra cellular matrixc,ECM)降解失衡等因素,加速了腎小球硬化,最終造成腎臟功能的喪失與衰竭[1],因此延緩腎臟纖維化,改善腎臟功能,對于慢性腎臟病的患者更加迫切。

近年來中藥復方在治療慢性腎臟病方面發揮著了獨特的優勢,很多在西藥難以控制的腎臟疾病在運用中醫辨證治療后,患者臨床癥狀均得到了明顯的改善。同時中醫復方還能在一定程度上減少腎病患者服用激素或者免疫抑制劑等西藥時引起的并發癥,改善了患者生活質量,因此中醫復方越來越得到大家關注和重視,腎間質纖維化的病名在我國古籍中并無記載,根據其特有的病理表現,可歸屬于中醫“水腫”、“癃閉”、“關格”、“癥瘕”、“虛勞”等范疇。其總體的病機為本虛標實,本虛中的脾腎虛損和標實中的濕熱、瘀血、濁毒是病機中的重要環節,前者是導致疾病發生、發展的病理基礎,后者則為疾病持續發展的重要原因。

目前中醫藥在防治腎間質纖維化方面已有大量的實驗研究,發現許多中醫復方均具有抗腎纖維化的作用?，F將近5年中藥復方治療腎間質纖維化的相關重要機制簡單介紹如下。

1 抑制細胞外基質(ECM)過度沉積

ECM的主要成分為膠原蛋白(collagen)、彈力蛋白(elastin)、纖維連接蛋白(FN)以及層黏連蛋白(LN),腎臟中ECM主要來源于成纖維細胞和肌成纖維細胞(MF)[2],在腎間質纖維化的腎臟中可檢測出大量的MF。成纖維細胞生理狀態下只產生少量的ECM,只有在受到炎癥等細胞因子刺激后轉化為MF,MF產生大量的膠原以及α平滑肌肌動蛋白(α-SMA),使腎臟中ECM過度沉積,破壞正常的腎臟結構。吳小燕等[3]以清化固腎排毒顆粒(黃芪、柴胡、白花蛇舌草、山藥、金錢草、大黃、白芥子)進行實驗研究,發現UUO大鼠ECM沉積減少,COL4、FN陽性表達顯著下降,腎纖維化程度緩解,證實清化固腎排毒顆?？赏ㄟ^下調COL4、FN的表達而達到改善腎纖維化的作用。朱苗蕊等[4]以HK-2細胞為研究對象,發現高糖誘導后ECM顯著增加,新加糖腎康(黃芪、生地黃等)干預后能夠通過抑制ECM成分ColⅠ、Col Ⅲ、FN的分泌而防治DN間質纖維化。呂雁等[5]研究發現益腎化瘀方(黃芪、菟絲子、制大黃、丹參、莪術)可明顯降低BUN、Scr,減少膠原生成,減輕腎小管損傷,證實益腎化瘀方可減少膠原生成,減緩腎間質纖維化。

2 促進細胞外基質(ECM)降解

基質金屬蛋白酶系統(MMPs/TIMPs)失衡是ECM降解減少的重要原因,基質金屬蛋白酶(MMPs)對于ECM具有很強的降解力,當MMPs被基質金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)阻斷活性時,ECM無法被及時降解,同樣也會導致ECM的過度沉積,加劇腎間質纖維化。張琳琪等[6]研究發現益腎化瘀方(黃芪、菟絲子、制大黃、丹參、莪術)可降低UUO大鼠TIMP-1mRNA水平以及纖維化程度,可通過平衡基質金屬蛋白酶系統MMP-1/TIMP-1,促進細胞外基質成分的降解從而起到保護腎臟的作用。張新志等[7]研究證明抗纖靈沖劑(制大黃、桃仁、當歸、丹參、牛膝)發揮抗腎間質纖維化的作用可能與MMP-9下調COL4α3基因及Col-Ⅳ蛋白表達,促進ECM降解來實現的。

3 調控纖維化因子及信號通路表達

3.1 調控TGF-β水平及相關因子表達 轉化生長因子(TGF-β)是腎間質纖維化進程中不可缺少的因子,TGF-β有三個亞型,其中 TGF-β1致纖維化作用最為顯著,不僅可以刺激成纖維細胞的活化,產生大量的膠原蛋白、FN、LN等加速ECM的沉積,同時抑制基質金屬蛋白酶活化,減少ECM的降解,使ECM合成和降解失衡,中藥復方也常將其作為治療RIF的關鍵靶點。魏曉露等[8]研究發現扶腎降濁方(山茱萸、生黃芪、白花蛇舌草、丹參、鬼箭羽、益母草)可明顯減少BUN、SCr、24hUPr,減輕腎組織病理損傷,降低TGF-β1和ColⅠ蛋白表達,升高HGF蛋白表達。證實扶腎降濁方可通過抑制TGF-β1和ColⅠ蛋白表達,促進HGF蛋白的升高,減少腎小管間質損傷而抑制腎間質纖維化。另有研究以阿霉素腎病大鼠為研究對象,證實補益脾腎方(黃芪、山茱萸、白術、三七、川芎)[9]通過調節TGF-β1和HGF表達,減緩腎間質纖維化。強勝等[10]研究證實固本泄濁飲(黃芪、蠶沙、首烏、黨參、生大黃等)可減少5/6腎切除大鼠中Scr、BUN含量,可通過下調TGF-β1,上調BMP-7蛋白表達,來延緩腎衰大鼠腎間質纖維化進展。栗睿等[11]以腺嘌呤致腎間質纖維化大鼠為研究對象,益腎排毒方(黃芪、土茯苓、當歸、茯苓、大黃等)干預8周后,發現各治療組TGF-β1、ColⅣ較模型組降低,證實益腎排毒中藥復方具有改善及延緩腺嘌呤導致腎衰竭大鼠的腎間質纖維化的作用。

TGF-β1是強效的誘導劑,在間充質基因表達過程中發揮重要作用,能夠促使腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化(EMT),進而增加間充質細胞標志蛋白α-SMA的表達,減少上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達[12]。Zhu等[13]研究證明祛菀陳莝方(丹參、大黃、牡丹皮、茯苓等)使UUO大鼠TGF-β1、α-SMA、E-cadherin顯著降低,可通過調節TGF-β1、E-cadherin等信號的表達,下調α-SMA水平,阻止腎纖維化的進展。

TGF-β還可以活化信號通路,其中Smad 信號傳導與RIF聯系最為密切。TGF-β可以磷酸化Smad2和Smad3使其活化,促進纖維化進程,而Smad7作為抑制型信號分子可以與Smad2、Smad3競爭受體,抑制纖維化進程。近年來,大量研究也證實了中藥復方可通過下調TGF-β表達,抑制信號通路活化,從而減緩腎間質纖維化。Chen等[14]實驗研究證實參芪丸(地黃、丹皮、山茱萸、茯苓、山藥、澤瀉等)可通過上調 Smad7,抑制 p-Smad2/3 的 mRNA和蛋白質表達,從而抑制TGF-β1/Smads信號通路,減少腺嘌呤大鼠中Scr、BUN、U-pro/24 h,減緩腎間質纖維化。Jiang等[15]以右腎切除的SD大鼠為研究對象,發現抗纖靈(丹參、大棗、牛膝、桃仁、淫羊藿)可降低BUN、Scr、24 h尿蛋白、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Col1a1、Col1a2和FN表達水平以及膠原纖維成分和間質細胞浸潤程度,證實抗纖靈可下調TGF-β/Smad傳導通路,發揮抗纖維化作用。陳宇等[16]研究發現清化固腎排毒方(黃芪、山藥、金錢草、大黃、白芥子)可下調Smad2/3及上調Smad7來抑制TGF-β1/Smads傳導通路起到延緩腎間質纖維化的作用。程濤等[17]以高糖環境誘導的HK-2細胞為研究對象,發現新加糖腎康(黃芪、生地黃等)能夠顯著減少TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白的表達,證實新加糖腎康能可以下調TGF-β/Smads信號通路起到減輕DN間質纖維化的作用。

3.2 調控 Wnt信號通路 有研究表明[18-20],很多不同的腎損傷類型都能發現Wnt/β-catenin 信號通路的表達,是引發腎損傷的重要信號通路。Wnt/β-catenin 信號通路可持續激活成纖維細胞,刺激多種炎癥因子表達,從而導致ECM大量沉積以及EMT,中藥復方可通過阻斷該信號通路因子的表達,緩解RIF。林文博等[21]研究發現腎病I號方(柴胡、黃芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝蓮等)可使UUO大鼠24hUP、Scr、BUN以及wnt4、β-catenin表達減少,膠原組織減少,證實腎病I號方發揮抗腎間質纖維化的作用可通過下調Wnt4和β-catenin的表達來實現。馬飛等[22]以UUO大鼠為研究對象,證實腎衰寧片可降低血CREA、BUN、尿mAlb水平,通過降低Wnt4和β-catenin表達減輕腎損傷,延緩腎間質纖維化。劉武[23]研究證實補腎消癥湯(黃芪、菟絲子、炒杜仲、淫羊藿、土鱉蟲、酒大黃等)可明顯降低UUO大鼠β-catenin、PAI-1蛋白表達,促進miRNA-139,MMP-7蛋白表達,證實建中補腎消癥湯可減緩腎間質纖維化,可能與干預miRNA-139表達從而調控Wnt/β-catenin信號通路相關。還有研究[24]證實健脾益腎方可在大鼠5/6 腎切除模型中上調E-cadherin的表達,并下調Wnt3a、α-SMA、β-catenin的表達,提供了健脾益腎中藥復方可以通過抑制Wnt3a/β-catenin來調控上皮間充質轉分化發揮抗纖維化作用。

3.3 調控PI3K/Akt信號通路 PI3K/Akt信號通路與轉化生長因子(TGF-β)、結締組織生長因子(CTGF)等促纖維化因子聯系密切[25],且PI3K/Akt信號通路可誘導單核/巨噬細胞浸潤,促進炎性因子的表達。有研究表明,PI3K/Akt信號通路的激活本身即可介導足細胞的損傷,即腎小球臟層上皮細胞結構和功能破壞,進而導致蛋白尿的出現[26]。楊婧等[27]以5/6腎切除大鼠為研究對象,腎衰Ⅱ號方(大黃、桃仁、川芎、黨參、丹參等)干預60天后發現用藥組大鼠Scr、BUN顯著減少,Ccr、Hb明顯增多,纖維化明顯減輕,p-Akt/pan Akt比值明顯降低,證實腎衰Ⅱ號方可通過下調PI3K/Akt信號通路的表達而減輕腎間質纖維化。張藝偉等[28]研究表明參地補腎膠囊(人參、熟地、大黃、白術、茯苓、甘草等)可通過降低UUO大鼠PI3K/AKT信號通路的表達,從而延緩腎間質纖維化進程。Luo等[29]研究證明,大黃黃芪湯(大黃、黃芪)可顯著降低UUO大鼠Scr、BUN以及PI3K、Akt、TGF-β1、α-SMA、IL-6的表達,腎小管萎縮和壞死、間質纖維化、細胞外基質增生和異常沉積明顯減輕,證實大黃黃芪湯可以潛在地調節PI3K/Akt信號通路,減少膠原沉積,延緩腎間質纖維化進一步加重。

3.4 調控SHH信號通路 SHH信號通路在RIF進程中發揮著重要作用,可誘導TGF-β1釋放,且SHH信號通路上調 Glil、Snaill 的表達,可促進EMT。Li等[30]以UUO大鼠為研究對象,發現腎衰靈方(大黃、龍骨、牡蠣、黨參、丹參、蒲公英等)可顯著降低UUO大鼠SCr、BUN,下調Gli1、snail1、Collagen I、α-SMA表達。證實腎衰靈方可抑制SHH-Gli1-snail1 信號通路的激活,降低纖維化細胞增殖,延緩腎間質進一步纖維化。

4 抑制血管緊張素系統活性

AngⅡ在RIF腎間質中的濃度高于血漿濃度幾十倍,AngⅡ可通過誘導成纖維細胞向MF轉化以及增加促纖維化因子(TGF-β1、CTGF等)表達,產生大量的ECM,促進間質細胞增生,同時還可以通過RASS系統影響水、電解質平衡以及腎臟血流動力造成不可逆的腎損傷。郭兆安等[31]實驗研究以切除右腎聯合注射鏈脲佐菌素的糖尿病腎臟病大鼠為研究對象,芪蛭降糖膠囊(黃芪、水蛭、黃精、黃芪、生地黃)干預12周后發現,芪蛭降糖膠囊用藥組Scr、24hUPQ、α1-MG、β2-MG、AngⅡ、ET-1BS、GSI、IF、TGF-β1明顯減少,NO顯著增高,證實芪蛭降糖膠囊可以通過抑制血管緊張素Ⅱ的分泌,從而減少TGF-β1表達,改善腎小球硬化,發揮抗纖維化作用。

5 抑制炎癥細胞相關因子表達

在受到炎性因子刺激時,上皮細胞、單核/巨噬細胞可產生大量的腫瘤壞死因子-α(TNF-α),TNF-α能促進巨噬細胞浸潤至受損的腎間質,并誘導巨噬細胞的促纖維化因子釋放增加,加劇腎間質的炎癥反應,引起成纖維細胞增殖及膠原的沉積[32]。張喜奎等[33]以桃核承氣湯(桃仁、大黃、桂枝、炙甘草、芒硝)進行實驗研究,干預8周后,證實桃核承氣湯改善腎間質纖維化與抑制炎癥因子CRP、TNF-α、IL-6表達有關。祝婷婷等[34]研究發現腎衰Ⅱ號方(大黃、桃仁、川芎、黨參、丹參等)可顯著降低5/6腎切除大鼠SCr、BUN、TNF-α的表達,減輕纖維化程度,減少炎性細胞的浸潤,證實腎衰Ⅱ號方可抑制促炎癥細胞因子TNF-α的表達,改善腎功能,減緩腎間質纖維化。強勝等[35]研究證實益氣養陰通絡方(太子參、海風藤、雞血藤、炙黃芪、熟地等)發揮抗腎間質纖維化作用與抑制IgA腎病大鼠TNF-α表達有關,可減少血尿、蛋白尿,減輕腎小球系膜基質增生。

有研究表明[36-38]阻斷NLPR3炎癥小體活化,可明顯緩解腎臟炎癥的發展。NLPR3炎癥小體活化后,可激活白細胞介素IL-1β、IL-18,進而加重炎癥反應,加快RIF進程。Wang等[39]研究發現,當歸補血湯(黃芪、當歸)可顯著減少UUO大鼠α-SMA、NLRP3、pro-caspase-1、白細胞介素-1β的前體、白細胞介素-1β,小管中間質損傷明顯減輕,間質膠原沉積明顯減少。證實當歸補血湯在UUO模型大鼠中起到了延緩間質纖維化的作用,與抑制NLRP3炎性體表達和減少細胞因子白細胞介素-1β的分泌有關。

6 抗氧化應激

氧化應激反應在RIF發生發展過程中占據重要地位,氧化應激是機體氧化/抗氧化系統失衡,導致活性氧(ROS)大量產生,引起組織產生不同程度的損傷。ROS的異常增多,可以促進TGF-β1等促纖維化因子表達,產生大量的ECM,同時可以直接攻擊腎臟各類細胞,造成細胞的壞死、凋亡。ROS也可以活化NF-κB 等信號通路,從而誘導纖維化以及炎癥等相關細胞、因子大量表達,加劇RIF的進展。Jin等[40]研究表明清腎顆粒(白花蛇舌草、薏苡仁、黃連、黃連、大黃、益母草等)干預4周后,可明顯降低UUO大鼠Scr、ROS、MDA、α-SMA,NF-κB 信號通路相關蛋白ICAM-1、MCP-1、NF-KBp65、p-IKBα、IKKα的表達減少,腎間質纖維化得到明顯延緩,腎小管損傷明顯減輕,表明氧化應激NF-κB信號通路有助于U腎間質纖維化的形成。證實清腎顆?？赏ㄟ^抑制氧化應激NF-κB信號通路、減少炎癥來預防RIF。Yuan等[41]以氯化汞誘導的SD大鼠為研究對象,扶正化瘀方(天花粉、絞股藍、桃仁等)可減少Hyp含量和膠原沉積,顯著增加GSH含量,降低NF-κB活性、MMP-2活性、p-IκB、TNF-α、MDA及α-SMA表達,證實了扶正化瘀方可以改善氯化汞誘導的腎間質纖維化的氧化損傷,并通過抑制IκB磷酸化拮抗氧化應激刺激的NF-κB活性,從而起到延緩腎間質纖維化的作用。Yang等[42]以缺氧誘導的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)進行體外分析,發現腎衰Ⅱ號方可減少FN 和 COL-I的表達,證實腎衰Ⅱ號方對腎臟保護作用可能與抑制缺氧有關,可以安全有效地減少細胞外基質產生以減緩腎間質纖維化。還有研究[43]證實通絡益腎湯(丹參、柴胡、紅花、菊花)通過抑制NLRP3介導的細胞焦亡來減輕缺氧誘導的NRK-52E細胞損傷,可以起到阻斷腎纖維化進一步進展的結果。

7 調節線粒體功能

線粒體是細胞生成三磷酸腺苷(ATP)的場所,是機體供能的來源所在。眾多研究表明[44-45],線粒體功能障礙是腎小管上皮細胞損傷的主要特征,在腎臟損傷持續進展過程中發揮重要作用。RIF進程中伴隨著水、電解質、酸堿平衡紊亂,線粒體結構和功能受到細胞環境影響,融合與裂變的平衡被打破,生成ATP減少,釋放大量的炎性因子,合成過量的ROS不僅會增加氧化應激反應,也會直接攻擊線粒體的核酸、酶類等,導致線粒體功能障礙加劇,生成更多的ROS,加重腎損傷,加速ECM沉積。隨著的發生發展RIF,腎單位也隨之遭到越來越多的破壞,機體則需要更多的ATP提供能量。線粒體功能障礙,ATP合成不足會加劇纖維化進程,中藥復方可通過恢復線粒體裂變/融合平衡,改善線粒體功能以緩解RIF患者病情。Liu等[46]研究發現健脾益腎方(黃芪、白術、肉蓯蓉、白豆蔻、丹參、大黃、甘草等)可明顯減少5/6腎切除大鼠Scr、BUN、尿蛋白及纖維標志物纖連蛋白、IV型膠原蛋白α-SMA,上調線粒體呼吸復合物的亞單位,增加PGC-1α(線粒體生物發生的主要調節因子)及其下游信號 NRF-1 和 TFAM的表達,從而恢復PINK1/Parkin介導的線粒體自噬,從而抑制Drp-1 的上調和 Mfn-2 和 OPA-1 的下調來增加線粒體的融合、減少裂變,腎小球肥大、腎間質纖維化在病理結果中顯現明顯減輕。證實健脾益腎方可通過調節線粒體質量控制網絡減輕腎結構損傷,保護腎功能,減緩間質纖維化。Liu等[47]另一項實驗研究證實治療健脾益腎方可降低Scr、BUN 以及FN、Col-IV、α-SMA蛋白表達,促進 QPRT/NAD+/SIRT3 信號并恢復線粒體裂變/融合平衡,減輕腎間質纖維化水平。黃芪丹參湯(黃芪、丹參)在實驗研究[48]中也被證實可減少線粒體分裂的主要調節因子Drp-1、Mid 51和Mid 49表達,促進Mfn-2表達和抑制OPA-1水解來恢復線粒體動力學,調節線粒體裂變/融合平衡,從而改善腎小管萎縮和間質纖維化。Wang等[49]實驗研究也證實了腎衰Ⅱ號方上調PGC-1α蛋白表達,改善線粒體形態和功能,抑制mtROS的產生以保護腎功能,延緩纖維化。

8 小結

綜上所述,不難發現中藥復方對于抗腎間質纖維化的實驗研究機制多集中于抑制ECM過度沉積、抑制炎性因子表達、抗氧化應激以及近年新興熱點——調節線粒體的相關功能,對于信號通路多集中于TGF-β1所介導的信號通路及因子表達。RIF是多種因素共同影響的動態病理改變,除了本文所涉及的TGF-β1、Wnt、NF-κB、PI3K/Akt以及SHH信號通路外,還有Notch、JAK/STAT多種信號通路和分子相互作用、協同調控RIF。因此,RIF的影響機制是中藥復方治療RIF,保護腎功能的重要靶點。上述研究發現,中藥復方在防治RIF的多環節都發揮了重要作用,中醫認為RIF的病機不外乎脾腎虧虛為本,濕熱、瘀血、濁毒為標,中藥復方在組方時也本著補腎健脾、利濕泄濁、活血通絡的治療原則,多使用黃芪、茯苓、枸杞、川芎、大黃、丹參等中藥進行組方配伍。大量的研究表明[50],這些中藥具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纖維化等現代藥理學作用,這恰好與RIF的發病機制相符。在上述研究中,同一中藥復方在治療RIF具有多種作用靶點,不同的中藥復方也可以抑制同一種機制,例如:腎衰Ⅱ號方可通過抑制PI3K/AKT信號通路活化[26]、下調促炎癥細胞因子TNF-α的表達[34]、抑制氧化應激反應[42]以及改善線粒體形態和功能[49]等多條途徑延緩RIF進程,參芪丸[14]、抗纖靈[15]、清化固腎排毒方[16]以及新加糖腎康[17]等多個中藥復方都可抑制TGF-β/Smad信號傳導通路活化,從而發揮抗纖維化的作用。這與中醫辨證論治以及各中藥相配伍,發揮其有效成分的作用息息相關。然而目前中藥復方對于單一機制之間尚缺乏串聯整合,在阻斷發病機制方面的各項研究尚且不夠深入[51]。雖然大量的實驗研究已經表明,中藥復方在組織、細胞、蛋白、基因等水平防治腎間質纖維化具有良好的效果,但由于中藥成分的復雜性,多種中藥配伍而成的中藥復方其成分更為復雜。因此,對于中藥復方及單味藥有效成分進行深入研究,剖析中藥復方如何多靶點、多層次、多環節的發揮抗腎間質纖維化作用,同時與現代科學相融合,為中藥復方在藥物、藥量等配伍組方提供更明確的依據,以期研發更多具有針對性、療效明確的臨床中藥制劑。