微生態制劑干預對社區糖尿病腎病患者腸道菌群的影響研究

沈菲，蔣偉萍，梅小斌，韓一平，趙家義，樊劍，顧娟，沈雁紅，徐紅梅，張丹，門英，丁海光，陳彩萍，韓君華*

糖尿病腎病作為糖尿病血管并發癥中常見的一種類型，主要變化是起始于腎小球以及腎小管肥大的結構改變，同時伴隨著腎臟基底膜增厚以及系膜的擴張，最終會進展為腎小球硬化、腎間質纖維化以及腎小管萎縮等[1]。在全世界范圍內糖尿病腎病是死亡率較高的疾病之一[2]。2016年的一項統計數據顯示，全球超過4億人患有糖尿病，超30%的患者最終會演變為糖尿病腎病[3]，然而糖尿病腎病的發病機制尚未完全明確，現有的醫療措施僅能夠延緩病情發展，無法治愈。

由人體腸道中的各類微生物菌落（真菌、細菌以及噬菌體等）所構成的共生環境即為腸道菌群，種類極其繁多，數量龐大[4-5]。細菌作為最多的微生物菌落，最常見的優勢細菌是乳酸菌、雙歧桿菌以及擬桿菌等[6]。腸道是此類菌群的代謝和活動場地，因此其代謝活性以及組成成分、比例發生改變就會導致腸道菌群失調，內環境失衡，繼而影響腸道功能[7-8]，同時也間接影響腸道外臟器（肝、腎等）的代謝活動。

近年研究顯示，腸道微生態結構和多樣性變化導致的菌群失調在糖尿病和慢性腎臟病中發揮著與疾病互相影響的作用[9]。一方面，細菌和細菌產物如脂多糖從內臟易位到血液，通過增加腸道通透性引起2型糖尿病、慢性腎臟病和終末期腎臟病典型的低度炎癥。另一方面，腸道菌群在物種豐富度、多樣性、組成和功能方面的變化可能會通過代謝物的營養利用和合成變化對宿主產生影響[10]。益生菌通過抗氧化應激和抗炎途徑發揮對糖尿病和腎臟疾病的治療作用，而氧化應激、慢性低度炎癥在基礎層面影響著糖尿病腎病。本研究旨在探究糖尿病腎病患者的腸道菌群特殊變化，根據微生態失調情況選取合適的益生菌制劑進行干預，了解微生態制劑療效，從而闡明糖尿病腎病發病和進展過程中腸道菌群結構變化所發揮的作用，明確腸道菌群與糖尿病腎病之間的聯系，為社區糖尿病腎病患者腸道菌群失調的有效治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采用分層隨機抽樣的方式選取2019年在上海市楊浦區殷行社區衛生服務中心就診的115例糖尿病腎病患者作為研究對象。根據1∶1比例平行對照設計試驗方案，設置顯著性水平（α）=0.05，置信區間（CI）=95%，采用雙側檢驗，結合計算公式并考慮臨床實踐中退出研究或失訪的可能性，設樣本量n=115。本研究經上海市楊浦區殷行社區衛生服務中心倫理委員會批準（倫理批號：2018-01），115例患者均簽署知情同意書。

納入標準：（1）符合糖尿病腎病診斷標準[11]；（2）年齡40～80周歲。排除標準：（1）特殊類型糖尿病以及妊娠期糖尿病；（2）研究開始前15 d以及研究期間出現腹痛、腹瀉等腸道疾病；（3）研究開始前15 d以及研究期間有各類益生菌以及腸道抗生素服用史；（4）其他原因引起的繼發性腎臟疾病，如高血壓腎病、IgA腎病以及腎炎綜合征、腎病綜合征；（5）患者并發其他內分泌性疾病（如甲狀腺功能亢進癥等）、惡性腫瘤、消化系統疾病、血液系統疾病等[12]；（6）患者并發糖尿病急性并發癥，如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病非酮癥性高滲性昏迷等。

1.2 相關定義及診斷標準

1.2.1 糖尿病 依據2019年美國糖尿病協會發布的糖尿病診斷標準[13]：（1）伴有糖尿病相關癥狀（多尿、多飲、多食以及體質量減輕），同時全天任一時間血糖≥ 11.1 mmol/L；（2）空腹血糖（FPG）≥ 7.0 mmol/L；（3）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）中2 h血糖≥11.1 mmol/L。以上3個標準中符合任一個即可診斷為糖尿病。

1.2.2 糖尿病腎病 依據《中國糖尿病腎臟疾病防治臨床指南（2019年版）》[11]，即由糖尿病引發的患者腎功能損傷，同時尿微量白蛋白與尿肌酐比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR）＞30 mg/g， 或 者患者的腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1，總持續時間超過 3 個月即可診斷為糖尿病腎病。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料 收集患者的一般資料，包括性別、年齡、體質指數（BMI）、早期糖尿病腎病比例（糖尿病腎病分期標準：早期指ACR為30～299 mg/g，中晚期指ACR ≥ 300 mg/g[14]）、糖尿病腎病病程。

1.3.2 實驗室檢查指標 采集患者清晨空腹外周靜脈血3～4 ml，并收集存放于無熱原的促凝管中，采血管做好相應標記[15]；分離血清，轉速4 000 r/min，時間5 min，分離后的血清采用EP管進行分裝（每管血清200μl左右），同時放置于-80 ℃的冰箱中低溫保存備用。FPG、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、ACR以及胱抑素C（Cys-C）均采用全自動生化分析儀進行檢測；C反應蛋白（CRP）采用免疫比濁法檢測；腫瘤壞死因子α（TNF-α）以及白介素（IL）-1β采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測。利用腎臟病膳食改良試驗（MDRD）公式計算估算的腎小球濾過率（eGFR），eGFR=186×〔Scr（mmol/L）/88.4〕-1.154× 年齡（歲）-0.203×0.742（女）[11]。

1.3.3 細菌培養 （1）細菌培養試劑：單原性培養基（賽默飛，500 ml/瓶）、冰醋酸（濟南鑫順化工有限公司，25 L/桶）、結晶紫（默克，25 g/瓶）、硫酸新霉素（默克，5 g/瓶）、迭氮鈉（捷世康，100 g/瓶）、卵黃液（環凱，5 ml/支）、布式肉湯（青島海博，250 g/瓶）。（2）細菌培養儀器：電子天平（上海精科天美，型號：JA2603B）、生物安全柜（賽默飛，型號：V147805）、恒溫培養箱（賽默飛，型號：V252445）、厭氧培養箱（徠譜，型號：HYQX-I）、培養皿（NUNC，型號：150462）。（3）糞便樣本收集：樣本收集前一晚用75%乙醇浸泡收集瓶，經0.9%氯化鈉溶液沖洗后分發至患者；患者取中段便置于收集瓶內，確保收集瓶內達到1/3容量；將每位患者的標本分為兩份，一份于-80 ℃冰箱中保存備用，另一份即刻做細菌培養[16]。（4）腸道細菌培養：將患者的糞便標本接種于雙歧桿苗、擬桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌及梭菌（均購自青島海博，250 g/瓶）的單原性培養基上。需氧菌于37 ℃普通培養箱培養，培養時間為72 h；厭氧菌于37 ℃厭氧培養箱培養，培養時間為72 h[17]。結果計算以每克濕糞的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）的對數值（lg CFU/g）表示。

1.3.4 微生態制劑干預方法 均衡糖尿病腎病患者的年齡、性別、尿微量白蛋白和菌群變化情況，利用簡單隨機抽樣法將115例糖尿病腎病患者分為兩組，一組給予控制血糖和血壓、降脂等常規治療（對照組，n=57）；另一組除常規治療外還給予雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片（內蒙古雙奇藥業股份有限公司，規格：0.5 g/片，國藥準字：S19980004，批號：201601077，用量：4片/次，2次/d）（治療組，n=58），兩組患者均治療8周。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以相對數表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 115例糖尿病腎病患者中男28例、女87例，平均年齡為（62.9±10.0）歲，糖尿病腎病病程為（14.3±7.1）年。對照組和治療組患者男性比例、年齡、BMI、早期糖尿病腎病比例、糖尿病腎病病程比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data of diabetic nephropathy patients with usual treatment， and those with treatment of microbiota-modulating agents

2.2 微生態制劑干預前后實驗室檢查指標比較 干預前，兩組患者各實驗室檢查指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，干預后治療組患者FPG、TG、BUN、Scr、ACR、Cys-C、CRP、IL-1β、TNF-α均降低，HDL、eGFR均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者微生態制劑干預前后實驗室檢查指標比較Table 2 Comparison of pre- and post-treatment laboratory test indices in diabetic nephropathy patients with usual treatment， and those with treatment of microbiota-modulating agents

2.3 微生態制劑干預前后腸道細菌培養結果比較 干預前，兩組患者各菌落數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；干預后，治療組患者腸球菌、腸桿菌菌落數低于對照組，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者微生態制劑干預前后腸道細菌培養結果比較〔M（P25，P75），lg CFU/g〕Table 3 Comparison of pre- and post-treatment bacterial culture results in diabetic nephropathy patients with usual treatment，and those with treatment of microbiota-modulating agents

3 討論

人體的腸道菌群在機體代謝活動中具有不可替代的作用，不僅參與腸道疾病的發生，同時還影響腸道外疾病的發展進程[18]。人體所需的維生素以及部分必需氨基酸就是由腸道內無法消化吸收的多糖經過腸道菌群轉化為單糖以及短鏈脂肪酸所提供，同時腸道菌群還可抑制病原微生物附著于腸道黏膜，激活補體旁路，中和微生物毒素，繼而調節機體免疫力[19-20]。腸道細菌是免疫系統發育和功能的重要組成部分。腸道菌群的變化可能是許多炎性疾病發生、發展的重要影響因素。生活方式的改變可能會改變腸道菌群組成比例，進而引發菌群失調。糖尿病腎病的病因和發病機制尚不完全清楚，可能系多因素參與，在一定的遺傳背景以及部分危險因素的共同作用下致病。本研究采用分層隨機抽樣的方式選取門診患者作為研究對象，研究微生態制劑改善腸道菌群對于糖尿病腎病患者的治療作用。

糖尿病腎病患者是否也存在腸道菌群失調的情況？部分學者認為，糖尿病腎病患者由于GFR的明顯下降，導致腸道的尿酸和草酸鹽無法正常排出體外并大量堆積于結腸段，繼而引起腸道內環境紊亂、酸堿失衡，引發菌群結構改變，最終導致菌群失調[21-22]。此外，GFR下降所引起的代謝廢物累積會透過腸壁進入腸腔，影響腸道益生菌生活環境，益生菌數量下降導致腸道菌群失調。同時，在腸道菌群失調的環境下，微生物的有毒有害代謝產物在腸腔釋放、累積，透過腸腔壁吸收入血，加速GFR的降低，最終影響腎功能。對于糖尿病腎病患者，由于腸道菌群失調，腸道上皮細胞屏障功能消失[23]，腸道內累積的大量尿素代謝產物如氨等會透過損壞的腸道屏障，繼而被吸收入血，隨血液循環至肝臟后，肝內重新合成尿素，加重腎小球濾過負擔[24]。并且尿素代謝產物氨還可在腸道內轉化為氫氧化銨，引起腸道pH值升高，腸道黏膜屏障功能進一步下降，腸腔內各類微生物代謝毒素均可透過屏障進入血液循環，最終導致全身炎性反應。

本研究結果顯示，與對照組相比，經過雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片干預后的治療組患者腸道中腸桿菌和腸球菌菌落數明顯下降，雙歧桿菌和乳酸桿菌菌落數明顯升高，可見腸道菌群失調程度明顯緩解，同時HDL、eGFR明顯升高，TG、BUN、Scr、ACR以及Cys-C等反映腎功能惡化的指標均明顯下降，可見患者腎功能有所恢復，最終菌群失調程度緩解的同時伴隨著患者腎功能的部分恢復，提示有效的微生態制劑利于調節腸道菌群，恢復菌群平衡，對于降低機體炎性因子水平具有重要作用。

脂多糖作為一種具有高度致炎性的G-菌細胞表面抗原，在體內一般通過Toll樣受體2（TLR-2）以及受體4（TLR-4）介導炎性反應。TLR-2和TLR-4可激活核因子κB，繼而誘導機體內促炎性細胞釋放IL-1以及TNF等炎性因子[25-26]，加劇全身炎性反應，促使腎功能進一步惡化，同時脂多糖引發的慢性炎癥還可促使胰島β細胞程序性凋亡，造成胰島素分泌不足，最終導致血糖調節功能進一步降低。YU等[27]研究發現，在糖尿病大鼠模型中，TLR-4在腎小球中的表達持續上調，血液中炎性因子IL水平明顯升高，伴隨尿白蛋白明顯增加，慢性炎癥加重，腎臟功能惡化。

綜上所述，腸道菌群失調與糖尿病腎病的進展具有緊密關聯，腸道菌群失調引發代謝性的炎性改變，影響GFR及腎功能，糾正腸道菌群失調可作為一項治療糖尿病腎病的新靶點[28]。合理應用益生菌、益生元等微生態制劑利于調節腸道的菌群環境，降低機體炎性反應，既能降糖調脂，又能減輕胰島素抵抗，對于糖尿病腎病的慢性炎癥具有積極治療作用[29]。

需要指出的是，雖然本研究顯示應用益生菌、益生元等微生態制劑可降糖調脂，減輕胰島素抵抗，對于糖尿病腎病的慢性炎癥具有治療意義，但是人體的腸道菌群本就是受到多種外界因素（如精神、壓力以及藥物）的影響，因此針對腸道菌群的研究設計仍存在一定的爭議；此外，本研究僅發現益生菌對于糖尿病腎病患者的腸道菌群具有調節作用，但是具體是通過哪一條路徑或者是哪一種因子介導來發揮治療作用目前不得而知，同時腸道菌群種類繁多，在益生菌特定的治療劑量或者治療濃度方面仍存在一定的爭議，有待進一步研究驗證。

作者貢獻：沈菲、趙家義進行研究的設計與實施、撰寫論文初稿；樊劍進行統計分析；顧娟、沈雁紅、徐紅梅、張丹、門英、丁海光、陳彩萍進行病歷資料收集與整理、研究評估與方案實施、表格制作；梅小斌、韓一平、韓君華進行質量控制及論文修改、審校；蔣偉萍等所有作者確認了論文的最終稿；沈菲、韓君華對論文整體負責。

本文無利益沖突。