中藥降脂復方對新西蘭白兔膽固醇-膽汁酸代謝的調節*

陳瑜，邱冬妮，孫思佳，卓家隆，廖陽勃，孫旭，毛奇琦，丁偉群，邱志兵，邵雷

復旦大學附屬華山醫院，上海 200040

高膽固醇血癥屬于一種代謝紊亂性疾病，隨著人們生活水平的改善及飲食習慣的改變，使得高膽固醇血癥具有較高的發生率[1]。高膽固醇血癥的發病周期長，治療較困難，目前尚無特效治療方法。高膽固醇血癥的出現可升高腦卒中、心肌梗死等心血管疾病的發生率，因此，對高膽固醇血癥做出診斷并及時干預，對于預防其并發癥具有重要意義[2-3]。目前，治療高膽固醇血癥的藥物有很多，治療效果存在差異，有些藥物降低膽固醇的作用顯著，但是其帶來的不良反應不容忽視。因此，找尋一種治療效果好、不良反應少的降膽固醇藥物是臨床的迫切需求[4]。中藥降脂復方的降脂效果已被臨床證明，且無明顯不良反應[5]。法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，FXR)是近年發現的對脂質代謝及糖代謝有調節作用的受體，在高膽固醇血癥患者中，FXR呈現過量表達[6]。在膽汁酸經典合成途徑中，膽固醇7α羥化酶(cholesteral 7α-hydroxylase，CYP7A1)是調節膽汁酸合成的限速酶[7]。與FXR類似，肝X受體(liver X Receptor，LXR)也是肝細胞內一種核受體，FXR被視為CYP7A1的轉錄抑制因子，LXR則為CYP7A1的轉錄激活因子。FXR正向調節靶基因有膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)與膽汁酸生理性配體小異源二聚體伴侶(short heterodimer partner，SHP)[8]。LXR的正向調節靶基因則是三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)[9]。上述靶基因mRNA大量表達可以反映其核受體處于激活狀態，反之則為非激活狀態。目前已有研究發現，FXR、LXR可通過介導相關的信號轉導通路來調節膽固醇向膽汁酸轉化的過程[10-11]。針對這一發現，本實驗選用新西蘭白兔作為研究對象，構建高膽固醇血癥模型，并對其進行中藥降脂復方干預，觀察各組干預前后CYP7A1的活性以及SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對表達量的改變，以探討中藥降脂復方對膽固醇-膽汁酸代謝的干預作用，為中藥降脂復方的臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 動物選取60只12～16周齡新西蘭白兔，體質量2.5～3.0 kg，購自河北醫科大學動物中心，合格證號：20118-0009，所有家兔均適應性喂養1周，室溫22～25 ℃，濕度50%～60%，自由攝食及飲水。本研究經復旦大學附屬華山醫院倫理審查委員會審批通過，倫理審批號：(2019)第(77)號。

1.2 藥物與試劑中藥降脂復方(規格：5 g/袋，南京厚生藥業有限公司，批號：20200113)；總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測試劑盒(上海名典生物工程有限公司，貨號：XY-50065)；總膽紅素(total bilirubin，TBIL)試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司，貨號：TW15954)；總膽汁酸(total bile acid，TBA)試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：ARB13142、BTN131042)；CYP7A1酶聯免疫吸附測定試劑盒(上海滬震公司，貨號：hz-M0394c)；Trizol試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號：R30506-50T)。

1.3 儀器OlympusAU600型全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)；ELX800型酶標儀(美國Bio-Tek公司)；ABI PRISM? 7300型定量PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模與干預方法采用隨機數字表法將新西蘭白兔隨機分為對照組、模型組、中藥降脂復方低劑量組和中藥降脂復方高劑量組，每組15只。對照組動物喂食普通兔糧，其余組新西蘭白兔給予高膽固醇兔糧(含2%膽固醇)，每只新西蘭兔每日總食量約為120 g，喂養4周，且中藥降脂復方低劑量組、中藥降脂復方高劑量組灌胃給予中藥降脂復方溶液(低劑量組2.5 g，高劑量組5 g，分別溶于20 mL生理鹽水中)。對照組、模型組每天每只白兔予以20 mL蒸餾水灌胃，連續干預4周。

2.2 血清學指標檢測分別于干預2周和4周進行檢測。白兔禁食禁水12 h后，采集2 mL兔耳緣靜脈血，常溫下4 000 r·min-1離心5 min后，留取血清待測。利用OlympusAU600型全自動生化分析儀進行以下指標的檢測：用酶水解法測定血清TC、TBIL的水平；用酶循環法測定血清TBA水平。

2.3 肝臟CYP7A1活性檢測執行采血及其他操作后，將動物處死，解剖動物，將其肝臟取出，并切成小塊于液氮中低溫保存。按照酶聯免疫吸附法試劑盒說明書操作，配置標準品與樣品，最終于ELX800酶標儀下讀取各孔在450 nm波長處的光密度值(optical density，OD)，制作標準曲線并計算CYP7A1的水平。

2.4 HE染色檢測肝臟病理變化新西蘭白兔采血操作完畢后，從耳緣靜脈注入烏拉坦進行麻醉，取肝臟右葉組織，多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋切片，進行病理檢驗。

2.5 RT-PCR實驗取300 mg肝臟組織，加入600 μL裂解液，制成勻漿；12 000 r·min-1離心 2 min；取400 μL上清液于EP管中，加入200 μL無水乙醇后轉移到吸附柱內，12 000 r·min-1離心 1 min，棄去廢液；加入500 μL RW液，12 000 r·min-1離心1 min，棄去廢液；將吸附柱置入EP管中，加入40 μL DEPC，靜置5 min，12 000 r·min-1離心 2 min；按照Trizol試劑盒操作說明提取總RNA并進行逆轉錄：37 ℃～15 min，85 ℃～5 s為1個循環；利用并遵照達輝生物公司生產的SYBRGreen PCR試劑盒進行PCR擴增：94 ℃～1 min，94 ℃～30 s，72 ℃～30 s循環230次；55 ℃～30 s，72 ℃～10 min，40 ℃～60 min保存。各基因引物序列見表1，PCR反應總體系為50 μL，內參選擇GAPDH。用ABI公司生產的ABI PRISM? 7300定量PCR儀檢測結果。

表1 各基因引物序列

3 結果

3.1 各組新西蘭白兔血清TC、TBA、TBIL水平比較干預前，各組新西蘭白兔血清TC、TBA和TBIL水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。干預2周及干預4周后，與對照組相比，各造模新西蘭白兔血清TC、TBIL水平升高，TBA水平降低；與模型組相比，各給藥組新西蘭白兔血清TC、TBIL水平降低，TBA水平升高；與中藥降脂復方低劑量組相比，中藥降脂復方高劑量組新西蘭白兔血清TC、TBIL水平降低，TBA水平升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表2、表3、表4。

表2 各組新西蘭白兔干預前后血清TC水平比較

表3 各組新西蘭白兔干預前后血清TBIL水平比較

表4 各組新西蘭白兔干預前后血清TBA水平比較

3.2 各組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性比較與對照組相比，各造模組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性降低；與模型組相比，各給藥組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性升高；與中藥降脂復方低劑量組相比，中藥降脂復方高劑量組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性比較

3.3 各組新西蘭白兔肝臟病理變化比較對照組新西蘭白兔肝臟組織結構正常；模型組可見肝細胞腫大，炎細胞浸潤；給予中藥降脂復方后，各組新西蘭白兔肝臟病理改變有所改善。見圖1。

注：A：對照組；B：模型組；C：中藥降脂復方低劑量組；D：中藥降脂復方高劑量組

3.4 各組新西蘭白兔肝臟SHPmRNA、BSEPmRNA、ABCA1mRNA表達水平比較與對照組相比，各造模組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對表達量升高；與模型組相比，各給藥組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對表達量降低；與中藥降脂復方低劑量組相比，中藥降脂復方高劑量組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對表達量降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1 mRNA相對表達量比較

4 討論

高膽固醇飲食是出現進展性高膽固醇血癥的主要原因[12-13]。研究表明，膽汁酸合成途徑及膽汁酸腸肝循環為膽汁酸-膽固醇代謝性疾病的發生機制及診斷治療提供了方向[14-15]。腸道是吸收膽汁酸的主要部位，膽汁酸還會隨糞便排出體外，膽固醇在肝內合成膽汁酸能夠彌補機體內丟失的膽汁酸[16-17]。FXR是肝細胞核內的膽汁酸受體，肝臟的膽汁酸可以激活FXR，調控與膽汁酸-膽固醇代謝相關基因的轉錄過程，如CYP7A1、SHP、BSEP等[18-19]。

本研究建立新西蘭白兔的高膽固醇血癥模型，并給予中藥降脂復方干預，探討模型白兔機體內膽固醇-膽汁酸的變化特點。結果顯示，新西蘭兔接受高膽固醇喂食后，其機體內TC和TBIL水平增高，TBA水平降低，應用中藥降脂復方可使攝入高膽固醇的新西蘭白兔血清TC和TBIL水平下降，TBA水平升高，劑量愈大，作用越好，提示中藥降脂復方可通過影響膽汁酸在腸道內的吸收，使進入肝臟的TBA水平降低，致使血清TBA水平升高。中藥降脂復方可抑制FXR的激活，并激活經典肝臟膽汁酸合成途徑，TBA水平增加后，彌補腸道內丟失的TBA，維持機體內TBA的穩定狀態，因在膽汁酸的合成過程中消耗掉了膽固醇及TBIL，肝臟從循環中攝取TC及TBIL的量增加，肝內膽固醇儲備減少，因而使機體內TC和TBIL含量下降。

本實驗結果表明，模型組、中藥降脂復方低劑量組和中藥降脂復方高劑量組肝臟CYP7A1活性顯著低于對照組；中藥降脂復方高劑量組肝臟CYP7A1活性顯著較中藥降脂復方低劑量組和模型組高。給予新西蘭兔高膽固醇喂養后，機體內膽固醇水平增加，激活膽汁酸替代途徑，并使膽汁酸池擴大，使CYP7A1的活性減弱。中藥降脂復方具有益氣健脾、清濁的作用。澤瀉、生蒲黃及山楂等藥材的降血脂作用顯著，這已在很多研究中得以證實[20-21]，澤瀉中的脂溶性部分含有三萜類化合物，是降血脂的有效成分，澤瀉醇A、B、C的乙酸酯及生蒲黃的黃酮類物質能夠顯著降低膽固醇水平，并促使膽固醇從腸道排出體外，從而使機體內膽固醇水平降低，丟失的膽固醇會向膽汁酸轉化，彌補膽汁酸水平，重建膽汁酸腸肝循環中新的平衡，此時會激活肝臟FXR進而激活CYP7A1轉錄途徑[22-23]。CYP7A1的激活得益于膽固醇降解和膽汁酸合成[24-25]。本研究結果顯示：模型組可見肝細胞腫大，炎性細胞浸潤，而中藥降脂復方低劑量和中藥降脂復方高劑量組肝臟病理有所改善，推測中藥降脂復方能阻止炎癥級聯反應，抑制肝損傷后炎性介質的分泌和釋放，從而減輕對肝細胞的損傷。

本研究結果顯示：模型組、中藥降脂復方低劑量組和中藥降脂復方高劑量組肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對表達量明顯高于對照組；中藥降脂復方高劑量組肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對表達量明顯低于低劑量組、模型組。長期高膽固醇攝入引起新西蘭兔血清TBA水平升高。高膽固醇血癥屬中醫學“痰濁”“眩暈”等范疇，中藥降脂復方有降低血脂作用，SHP和BSEP是FXR正向調節靶基因，ABCA1則相反[26-27]。應用中藥降脂復方可抑制FXR的激活狀態，促進膽汁酸經典合成途徑，BSEPmRNA、SHPmRNA大量表達激活了SHP，促使ABCA1基因調控區與SHP復合為活性結合物，使得ABCA1mRNA表達水平顯著增加。

綜上所述，中藥降脂復方能有效調節新西蘭白兔膽固醇-膽汁酸代謝，可能與調控SHP、BSEP及ABCA1有關。本研究通過構建動物模型較為全面地探討了膽汁酸-膽固醇代謝疾病的發病機制，為疾病的診斷、新靶點的確認提供依據。