針刺次髎對大鼠自主神經系統相關神經元放電頻率的影響*

潘彥宏，詹錚，姜勁峰

南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023

次髎位于足太陽膀胱經，臨近胞宮，而任督二脈、沖脈皆起于胞宮，因上述經脈走行范圍廣泛及穴位的遠治作用，次髎穴在臨床上的應用范圍隨之增加。研究發現，針刺次髎穴不僅可以治療腰骶部運動系統疾病和盆腔器官相關疾病[1]，亦可治療局灶性疾病[2]、全身性炎癥疾病[3]，并降低內臟高敏狀態[4]。

骶神經刺激(sacral nerve stimulation，SNS)可通過“脊髓-中樞”環路激活膽堿能通路改善急性結腸炎癥狀[5]，而電針次髎穴可作為SNS的臨床轉化方法。本課題組研究證明，電針“次髎”能夠降低脂多糖所致全身重度炎癥模型大鼠的血清炎癥因子水平，提高致死性內毒素血癥模型大鼠生存率[6]。從選擇軀干部位的相似性到上述實驗的結果，兩種刺激方法存在高度的一致性，都需要頸迷走神經及中樞膽堿能受體參與。故而推測，電針次髎亦可通過膽堿能通路發揮全身性抗炎效應。針刺八髎區域穴位可不經過迷走傳入途徑，而是經由“脊髓-中樞”環路直接作用于腦部迷走神經復合體(dorsal vagal complex，DVC)，從而引發相應的效應。迷走神經被認為是腦和免疫系統之間的雙向連接器，其中樞端涉及腦干部位的DVC核團[7]。已有研究證明，骶神經刺激可增強孤束核c-fos陽性表達及外周迷走神經活性，本課題組實驗亦證明迷走神經與盆神經參與次髎穴的抗炎效應，然而針刺次髎對孤束核與外周迷走神經的具體影響未見報道。

大量實驗證明，交感環路在機體抗炎中發揮重要作用[8-10]，內臟大神經介導軀體所調控的全身性炎癥反應[11-12]。Martelli等[13]研究發現，交感神經在炎癥反射中比迷走神經更強大，而針刺次髎對于交感神經系統的影響尚未見報道。基于此，本研究觀察針刺次髎對于孤束核、迷走神經、藍斑核放電的影響。

1 材料

1.1 動物健康成年雄性SD大鼠48只，30只體質量300～320 g，18只體質量230～250 g，由浙江省醫學科學院提供，動物生產許可證編號：SCXK(浙)2019-0001。所有動物飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心，室溫(22±2)℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h明暗周期交替飼養。本實驗通過了南京中醫藥大學動物倫理委員會的倫理審查，倫理批號：012021001085。實驗過程嚴格遵循“3R”原則，遵照科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規定，進行充分麻醉。

1.2 藥物與試劑烏拉坦(又稱氨基甲酸乙酯，化學純，上海麥克林生化科技有限公司，批號：20201030)；滂胺天藍、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(美國Sigma公司，批號：2610-05-1、L8880)；無水乙酸鈉、石蠟油(分析純，南京化學試劑有限公司，批號：20200111、20200228)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 ELISA測定試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司，批號：LZ-T6870、LZ-H6036、LZ-H7216)。

1.3 儀器HANS-200型電針儀(南京濟生醫療科技有限公司)；(10)22100821型一次性無菌針灸針(規格：0.35 mm×25 mm，北京中研太合醫療器械有限公司)；TDL4-T型低溫離心機(德國Eppendorf公司，離心半徑：8.0 cm)；RT-6100型酶標儀(美國Rayto公司)；JB-1028型腦立體定位儀(美國David Kopf Instruments公司)；PC-100型微電極操作控制器(日本Narishige公司)；1700型細胞外電生理記錄放大器(美國A-M systmmes公司)；Mi-cro3-1401型生理信號采集分析系統(英國CED公司)；H-KWDY-Ⅲ型溫控儀(南京市泉水教學實驗器材廠)；ALC-CED6型電動顱骨鉆(上海奧爾科特生物科技有限公司)；WD-1型玻璃微電極拉制儀(成都儀器廠)；B120-90-10型玻璃微電極(規格：100 mm×1.2 mm，南京市泉水教學實驗器材廠)。

2 方法

2.1 分組、造模與干預方法動物適應性飼養1周后，分為實驗一組和實驗二組，其中實驗一組為體質量230～250 g的18只大鼠，隨機分為正常組、模型組與次髎組，每組6只。術前動物禁食12 h，不禁水，大鼠腹腔注射體積分數20%烏拉坦(1.0 g·kg-1)進行麻醉后，正常組大鼠根據體質量以0.67 mL·kg-1的劑量腹腔注射9 ng·L-1氯化鈉溶液，模型組與次髎組則以1 mL·kg-1的劑量腹腔注射LPS(6 mg·kg-1)制備全身重度炎癥模型[14]。造模完成后，參照文獻[15-16]對大鼠次髎穴進行定位，大鼠S2相當于人類的中髎和次髎穴，位于第2、第3骶骨棘突間隙正中旁開約5 mm。電針次髎時，電流強度以大鼠雙下肢內收內旋、尾巴震動為準[17-18]，頻率 30 Hz，波寬(0.2±0.06)ms，于造模前后各電針 30 min。實驗二組為體質量300～320 g的30只大鼠，隨機分為孤束核組、藍斑組與迷走神經組，每組10只，無需造模，直接進行左側次髎穴直刺干預，進針深度為15 mm，施以手法(捻轉120°、頻率80次·min-1)刺激30 s。

2.2 神經元放電細胞外記錄實驗二組大鼠術前禁食12 h，自由飲水，以體積分數20%烏拉坦(1 g·kg-1)腹腔注射進行麻醉。孤束核組、藍班組：大鼠俯臥位，用耳棒將大鼠雙耳固定在腦立體定位儀上，于頭正中線切開皮膚，分離皮下組織、骨膜，暴露顱骨，調整前后囟高度使其保持在同一條水平線上。實驗過程中使用加熱毯將動物體溫維持在37～39 ℃。按照Paxinos G和Watson C圖譜[19]定位左側孤束核(坐標：AP=11.0～11.4 mm，RL=1.0 mm，H=5.6 mm)及左側藍斑(坐標：AP=11.6 mm，RL=1.0 mm，H=5.6 mm)，牙科鉆除去對應定點部位的顱頂骨，在顯微鏡下小心去除硬腦膜，用38 ℃石蠟油覆蓋，保護腦組織。采用充置含1%滂胺天藍的 0.5 mol·L-1醋酸鈉電解液的玻璃微電極(尖端0.5～2 μm，阻抗：10～20 mΩ)通過微電極操作器控制到達目標核團，探查神經元放電，進行細胞外記錄[20]。當神經元自發放電信號出現時，上下調整推進器位置至信噪比較大時停止推進，電極尖端停留在放電神經元處，觀察其穩定放電后開始記錄。所記錄放電信號經前置放大器放大，輸入生理信號采集系統進行數據采集，使用Spike 2軟件進行數據記錄與分析。根據上述大鼠腦立體定位圖譜所定位置，孤束核組采用微電極垂直進入腦部，而記錄藍斑時，玻璃微電極針尖向大鼠頭面方向沿矢狀面傾斜15°(避開橫竇)進入腦部，其余實驗步驟與孤束核組一致。迷走神經組：從大鼠頸前胸鎖乳突肌做切口，逐層剪開皮膚、肌肉，暴露頸動脈和迷走神經，迷走神經主干位于頸椎中段，用玻璃分針輕柔地分離頸動脈和迷走神經，充分暴露迷走神經后，滴入 34～38 ℃的溫熱石蠟油浸浴神經。將自制的引導電極從分離出的迷走神經穿過，參考電極置于切口處的皮下。神經放電產生的電信號經引導電極和參考電極傳入前置放大器，放大后經過過濾被生物信號采集分析系統采集轉變成圖像顯示在電腦上。放電信號穩定后，首先記錄正常放電30 s作為基線對照，隨后針刺穴位給予刺激30 s，同時觀察并記錄孤束核神經元、藍斑神經元與迷走神經電活動30 s，記錄結束后取針。完整記錄一個循環(基線-針刺-取針)保存為該穴位組的樣本數據。

2.3 組織學定位神經元放電細胞外記錄結束后，采用數顯直流穩壓電源刺激器向玻璃微電極通 20 μA 負向直流電20～30 min，將玻璃微電極內的滂胺天藍醋酸鈉溶液導入腦組織以標記位置。隨后取腦組織并固定于40 ng·L-1多聚甲醛溶液中 72 h，保存于 4 ℃ 冰箱中。取出后置于20%蔗糖溶液中4 ℃浸泡12 h，再置于30%蔗糖溶液中4 ℃浸泡12 h后進行梯度脫水。脫水后用冰凍切片機制備50～60 μm 厚的腦切片，觀察染色，檢查記錄點位置。完整記錄一個循環數據并且位置準確者，方可納入最終統計分析數據。

2.4 ELISA檢測血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平ELISA法檢測實驗一組大鼠血清炎性因子含量。實驗一組大鼠在造模3 h后經腹主動脈取血3mL，靜置30 min，2 000 r·min-1離心 20 min 后取上清液存于-80 ℃冰箱。按照試劑盒說明書檢測標準品與待測樣品的濃度，據不同濃度標準品吸光度值繪制標準曲線，再根據標準曲線計算各組樣本的實際含量。

3 結果

3.1 針刺次髎穴對全身重度炎癥模型大鼠血清炎性因子的影響與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加；與模型組比較，次髎組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.000 1)。見圖1。

注：與正常組比較，***P<0.000 1；與模型組比較，###P<0.000 1

3.2 針刺次髎穴對孤束核神經元放電頻率的影響實驗共觀察記錄到20個神經元，與本組針刺前比較，針刺后大鼠孤束核神經元放電頻率增高，差異有統計學意義(P<0.001)，結果表明，針刺次髎穴可提高孤束核神經元自發放電的頻率。見圖2、圖3。

注：A：左圖為腦組織切片圖(前囟Bregma-11 mm)，藍染處為NTS記錄點，右圖紅色區域為組織圖示冠狀切面NTS所在位置(前囟Bregma-11.04 mm)；B：左圖為腦組織切片圖(Bregma-9.8 mm)，藍染處為LC記錄點，右圖紅色區域為組織圖示冠狀切面LC所在位置(Bregma-9.84 mm)

注：A：針刺次髎穴后孤束核神經元放電示意圖；B：神經元放電頻率量化圖，與針刺前比較，**P<0.001

3.3 針刺次髎穴對藍斑神經元放電頻率的影響實驗共觀察記錄到14個神經元，與本組針刺前比較，針刺后大鼠藍斑神經元放電頻率增高，差異有統計學意義(P<0.01)，結果表明，針刺次髎穴可提高藍斑神經元自發放電頻率。見圖4。

注：A：針刺次髎穴后藍斑神經元放電示意圖；B：神經元放電頻率量化圖，與針刺前比較，##P<0.01

3.4 針刺次髎穴對迷走神經放電頻率的影響與本組針刺前比較，針刺后大鼠迷走神經放電頻率增高，差異有統計學意義(P<0.05)，結果表明，針刺次髎穴可提高迷走神經自發放電的頻率。見圖5。

注：A：針刺次髎穴后迷走神經放電示意圖；B：神經元放電頻率量化圖，與針刺前比較，#P<0.05

4 討論

課題組前期研究已證明頸迷走神經可參與電針次髎的抗炎效應[6]。本次研究結果指示，針刺次髎可明顯激活NTS，促進外周迷走神經放電，與前期研究結果一致。另外，已證實SNS可顯著提高心率變異性中HF的比值、外周迷走神經活性及腸壁中ChAT+陽性表達，故本次研究為針刺次髎作為SNS的臨床轉化方法增添了基礎證據。此外，本研究還發現針刺次髎穴可激活藍斑神經元，此前未見有文章報道。

針刺次髎穴或可激活脊髓上中樞、啟動自主神經通路，實現次髎的抗炎效應。頸迷走神經刺激、經耳迷走神經刺激與電針足三里分別通過直接激活迷走神經與軀體-自主神經反射啟動迷走環路，將信息傳達腦干部位的DVC核團，發揮膽堿能抗炎效應[21-23]，降低脂多糖致全身重度炎癥模型大鼠的死亡率與致炎因子。不同的是，電針次髎降低脂多糖致全身重度炎癥模型大鼠死亡率的效果不僅僅是頸迷走神經與盆神經的參與作用，或仍存在交感神經系統的參與作用。在電針深刺次髎治療膀胱過度活動中，不僅激活了副交感屬性的盆神經，也激活了胸腰髓交感神經中樞發出的腹下神經(交感屬性)[24]。臨床實驗發現，針刺次髎穴或可通過抑制外周和中央傷害部位中的環氧化酶合成，產生抗炎作用[25-26]。針刺次髎穴還可降低慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者中前列腺素E2的高表達，前列腺素E2可介導炎癥和疼痛感知，與交感神經興奮性成反饋性調節[27]。因此，針刺次髎穴不僅可提高外周迷走神經活性，還可增強交感神經興奮性從而促進軀體全身性抗炎效應。

針刺次髎穴可調節機體的排尿、排便和性功能，證明針刺次髎穴的副交感調節屬性[28]。另一方面，由于骶叢副交感中樞是交感屬性[29-31]的討論引發了關于其自主神經功能方向的爭議。有研究提示，傳入迷走興奮可引發交感屬性的內臟大神經抗炎通路的激活[32-33]，由此推測，針刺次髎穴對交感神經系統的影響存在副交感神經纖維的參與。對高位中樞損傷模型小鼠進行盆腔輕刺激，如膀胱充盈，傳入腰骶脊髓可導致交感神經節前纖維的高度興奮及病變水平以下的大量交感神經放電，引發肌肉、內臟和皮膚血管的收縮，致軀體炎癥過度而出現免疫抑制[34-35]，揭示了傳入膀胱充盈感覺的盆神經纖維的激活可引發延髓水平的交感節前纖維興奮。針刺次髎可激活盆神經與腹下神經，腹下神經(交感神經屬性)主要傳導膀胱痛覺，而高位中樞損傷模型小鼠多因尿潴留與便秘而非盆腔疼痛引發免疫抑制與高血壓性自主神經反射障礙，故推測針刺次髎是以副交感傳入纖維為入口引發軀體的副交感傳出與交感激活效應。

次髎穴是體表刺激調節副交感神經途徑的方式之一[36]，針刺通過軀體-自主神經反射激活迷走神經從而發揮全身性的抗炎作用。在此之前，電針治療脂多糖致全身重度炎癥模型大鼠多采用內關、足三里與天樞等穴[37]，次髎穴的研究為其添加了新的內容。結合本課題組的實驗結果可知，次髎穴的全身性抗炎效應或為增加副交感傳入，提高脊髓上自主神經中樞興奮性而實現。針刺次髎穴后，孤束核神經元與藍斑神經元放電頻率的改變存在差異。因實驗條件有限，實驗數據多在傍晚或夜間獲取。大鼠腦干部位的孤束核與藍斑分別代表腦部的副交感中樞與交感中樞，二者在麻醉狀態下存在生理性差異。根據經典的“flip-flop switch”模型[38]，認為促覺醒的單胺能細胞群可向下丘腦的睡眠調控中樞-腹外側視前區(ventrolateral preoptic area，VLPO)發送抑制性輸出，從而產生覺醒促進作用，藍斑分泌的去甲腎上腺素參與其中的調節喚醒，且在麻醉狀態下藍斑神經元的自發放電頻率迅速降低。

實驗二組大鼠因電刺激次髎時的電磁干擾，影響了儀器對神經元放電的實時檢測，故而采用手針的刺激方式。手針的刺激在明顯弱于電針刺激(實驗一所用參數)的情況下，依舊得出明顯的實驗成果，足以說明次髎穴對于自主神經系統的特異性調節作用。

綜上，次髎穴的中樞整合端位于腦干部位的自主神經系統相關核團，針刺次髎穴可通過促進核團神經元放電頻率干預軀體自主神經功能調節。