新生兒缺氧缺血性腦病血清miR-384與炎癥反應、神經行為的相關分析

王 彤，楊國穎，趙凱紅，邢 燁，田 勃

(唐山市婦幼保健院新生兒科，河北 唐山 063000)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)主要因圍產期窒息所致，發病機制較復雜，既往研究指出其可能與炎性細胞因子有關，同時氧自由基增加、脂質過氧化等可能共同參與了HIE進展，能誘發腦水腫、神經元壞死等病理改變，促進神經纖維性質改變[1]。HIE癥狀包括抽搐、意識狀態改變、原始反射異常等，患兒死亡率較高，預后欠佳，部分患兒還會出現不同程度的后遺癥，例如智力低下、癲癇、腦癱等[2]。因此，臨床需進一步探究HIE的發生與進展機制，以期為該病治療提供依據。

目前，有學者指出微小分子核糖核酸(microRNA，miR)與多臟器損傷有關，當臟器處于缺氧、缺血狀態時能促進炎癥因子分泌，將特定信號路徑激活，上調相關基因表達，促進細胞壞死，miR可能參與了相關基因的調控過程[3]。動物實驗發現miR-384-5p(從miR-384前體的5′端臂加工而成)表達與大鼠神經細胞凋亡有關，在大鼠皮質受損后可見miR-384-5p表達下調[4]，提示miR-384可能在腦神經病變中有調節作用。另有研究認為miR-384表達下調可能通過敲除環狀RNA染色質重塑因子(Circular RNA bromodomain PHD finger transcription factor，circBPTF)對機體炎癥免疫進行調節，使高糖誘導的免疫炎癥紊亂改善，緩解應激反應[5]。而炎癥與HIE進展密切相關，當腦中樞組織受到損害時，可引起固有免疫系統受損，致大量炎癥介質釋放，加重HIE患兒的腦組織損害[6]，但目前針對miR-384是否通過調節炎癥免疫影響HIE患兒的病情尚無定論。動物實驗提示HIE與免疫功能異常有關，窒息缺氧能引起T細胞亞群異常，導致淋巴細胞凋亡加速及輔助性T細胞17/調節性T細胞(helper T cell 17/regulatory T cell，Th17/Treg)失衡，誘發免疫功能紊亂，提示Th17/Treg失衡可能在HIE中發揮了調節作用[7]。而目前尚不明確miR-384與Th17/Treg平衡及HIE之間的關系，基于此，本次研究納入106例HIE新生兒進行研究，分析其miR-384表達水平與炎癥反應、Th17/Treg失衡、神經行為的相關性，以期為HIE臨床治療提供思路，報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2015年10月至2020年10月唐山市婦幼保健院收治的106例HIE患兒為HIE組，另選取同期同院產科分娩的90例健康新生兒為對照組。HIE診斷標準：參考《新生兒缺氧缺血性腦病.第2版》[8]：①孕婦既往有可能引起胎兒宮內窘迫的產科病史，且伴有胎兒宮內窘迫癥狀(例如羊水Ⅲ度污染，胎心<100次/min，且持續時間≥5min)或者在分娩過程中有明顯窒息史；②出生時存在重度窒息，即1min Apgar評分≤3分，延續至5min Apgar評分仍≤5分，或者臍動脈血氣PH≤7.00；③新生兒出生后發生意識改變、原始反射異常、肌張力改變等神經系統異常表現，持續時間>24h；④排除其他原因(如產傷、顱內出血等)所致的抽搐及宮內感染、遺傳代謝性疾病和其他先天性疾病所引起的腦損傷，滿足上述4條則可確診。納入標準：①HIE組：符合上述診斷標準者；未見先天遺傳性疾病者；胎齡37～42周者；患兒監護人對研究內容知情同意。②對照組：同期于我院產科分娩的健康新生兒；胎齡37～42周者；孕婦孕期健康；Apgar評分為8～10分者；患兒監護人對研究內容知情同意。排除標準：因遺傳代謝性疾病或其他先天疾病所致的腦損傷者；先天畸形者；顱內出血者；孕婦有妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓等合并癥；機體嚴重感染者；腦結構發育異常者。研究方案獲醫院倫理委員會批準。

1.2檢測方法

1.2.1炎癥因子、Treg、Th17及其他細胞因子檢測

兩組新生兒采集4mL外周血，分裝于兩管。其中一管血樣離心10min，轉速3 000r/min，分離血清，存至-70℃環境待測。經酶聯免疫吸附法檢測血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司，經霍爾德HED-SY96S自動酶標儀(山東霍爾德電子科技有限公司)測定；另一管血樣加入抗凝劑，存至-70℃環境待測，經貝克曼庫爾特DxFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)測定Treg、Th17水平，計算Th17/Treg值。

1.2.2血清miR-384檢測

另取2mL外周血，離心方式同上，取血清存至-70℃環境待測。經實時逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測miR-384。主要試劑為總RNA提取試劑、逆轉錄試劑、qPCR試劑、異丙醇、氯仿，均由賽默飛世爾科技公司提供。主要儀器為TG-16W高速離心機[愛來寶(濟南)醫療科技有限公司]、KS48+型PCR擴增儀[冠森生物科技(上海)有限公司]、F3微量移液器(賽默飛世爾科技公司)。具體如下：嚴格根據試劑說明書提取總RNA，待提取完畢，取RNA液體2μL測定純度，分析A260/A280值，若二者比值在1.6～1.9之間，則提示純度滿足檢測要求。針對總RNA液體進行逆轉錄，使其合成cDNA，將cDNA產物冷卻，并行PCR擴增，反應條件如下：95℃預變性30s；95℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，共進行40個循環。引物序列為①miR-384：上游5′-GCCGAGATTCCTAGAAATTG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；②內參引物U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。利用2-△△CT表示miR-384表達水平，取3次試驗均值為最終結果。

1.3 HIE分組與評價標準

根據HIE分度標準將患兒分成輕度組(n=37)、中度組(n=44)、重度組(n=25)。HIE分度標準[8]①輕度：意識處于興奮與抑制交替的狀態，肌張力稍微增高或者正常，擁抱反射良好，吸吮反射正常，可能伴有肌陣痙攣，未見中樞性呼吸衰竭，瞳孔擴大或正常；②中度：嗜睡，肌張力有所下降，擁抱、吸吮反射減弱，常有驚厥，伴有中樞性呼吸衰竭，瞳孔常縮小；③重度：昏迷，肌張力松軟，擁抱、吸吮反射消失，持續驚厥，伴明顯中樞性呼吸衰竭，瞳孔擴大，對光反射延遲。

新生兒神經行為量表(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評分[9]：包括原始反射(3項)、行為能力(6項)、一般反應(3項)、主動肌張力(4項)與被動肌張力(4項)5個維度，共20個條目，每項計0～2分，總分范圍為0～40分，總分35分以下提示神經功能異常，分值越高表明神經功能越好。

1.4統計學方法

2結果

2.1兩組基線資料比較

兩組性別、胎齡、新生兒出生體重及分娩方式比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2兩組血清miR-384、炎癥因子及NBNA評分比較

HIE組血清miR-384水平及NBNA評分低于對照組，IL-6、CRP、TNF-α水平高于對照組，差異均有統計學意義(t值介于-21.533～30.802之間，P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清miR-384、炎癥因子及NBNA評分比較

2.3兩組Th17、Treg及Th17/Treg比較

HIE組Treg水平低于對照組，Th17、Th17/Treg水平高于對照組，差異均有統計學意義(t值介于-6.166～8.390之間，P<0.05)，見表3。

表3 兩組Th17、Treg及Th17/Treg比較

2.4不同臨床分度HIE患兒血清miR-384、炎癥因子及NBNA評分比較

HIE輕、中、重度組血清miR-384水平及NBNA評分均依次降低，IL-6、CRP、TNF-α水平均依次升高，差異有統計學意義(F值介于82.368～225.418之間，P<0.05)，見表4。

表4 不同臨床分度HIE患兒血清miR-384、炎癥因子及NBNA評分比較

2.5不同臨床分度HIE患兒Th17、Treg及Th17/Treg比較

HIE輕、中、重度組Treg依次降低，Th17、Th17/Treg均依次升高，差異有統計學意義(F值介于135.487～513.891之間，P<0.05)，見表5。

表5 不同臨床分度HIE患兒Th17、Treg及Th17/Treg比較

2.6 HIE患兒miR-384與炎癥因子、Th17、Treg、NBNA評分的相關性

經Pearson線性相關分析提示，HIE患兒血清miR-384與IL-6、CRP、TNF-α、Th17、Th17/Treg呈負相關(r值介于-0.867～-0.406之間，P<0.05)，與Treg、NBNA評分呈正相關(r值分別為0.671、0.776，P<0.05)，見表6。

表6 HIE患兒miR-384與炎癥因子、Th17、Treg、NBNA評分的相關性

3討論

3.1 HIE發病現狀及基礎機制分析

研究表明在我國活產兒中，約3‰～6‰出現HIE，死亡率約為15%～20%，即便患兒存活，仍有約25%～30%發生不同程度的神經系統后遺癥[10]。盡早對患兒進行治療，可以改善其預后。研究指出免疫炎癥反應參與了HIE發病與進展過程，炎癥因子可通過炎癥細胞、免疫細胞產生，對細胞功能有調節作用；促炎因子的過度釋放能啟動炎癥機制，擴大炎癥反應，加重HIE所致的神經損害[11]。Th17/Treg失衡也與HIE有關，二者失衡通常表現為與之相關的促炎因子釋放增加，而抗炎因子釋放減少，引起炎癥免疫紊亂，促使腦組織功能損害[12]。有學者發現某些miRNA在組織處于缺氧、缺血時存在異常表達，miRNA的轉錄水平對蛋白功能有一定影響，參與其凋亡、生長等過程，它通過對基因轉錄后沉默進行介導，從而在HIE中發揮作用[13]。臨床通過分析相關的miRNA在HIE中的作用，可能對該病治療具有一定指導意義。

3.2 HIE與炎癥因子、miR-384表達、Th17/Treg失衡的關系

本研究提示與健康新生兒相比，HIE患兒的血清IL-6、CRP、TNF-α水平明顯增高，而NBNA評分下降，表明患兒存在炎癥反應，且神經行為能力相對較差。IL-6是一種促炎因子，在中樞神經系統防御、損害過程中發揮了重要的調節作用，在出現HIE后可導致IL-6水平迅速上調，它能促使炎癥細胞在病變部位大量聚集，促進中性粒細胞釋放大量的毒性氧基，加重HIE損害[14]。CRP、TNF-α對炎癥介質釋放有激活作用，能促進局部炎癥損害，且對黏附因子釋放、合成存在誘導作用，致腦損害加重[15-16]。

本研究結果顯示HIE患兒的血清miR-384表達量較正常新生兒明顯降低。目前，動物研究發現在中樞神經功能損傷后，海馬體中miR-384-5p存在異常表達[17]，表明其可能參與了中樞神經毒性進展，與腦損害發生存在關聯。Liu等[18]認為miR-384對腦中樞神經元的調節機制比較復雜，可能通過Snhg8/miR-384/Hoxa13/FAM3A軸發揮作用，其中Snhg8過表達能調控miR-384發揮抗細胞凋亡作用，而miR-384表達能靶向其3′UTR影響Hoxa13表達，Hoxa13則能與FAM3A啟動子結合，對神經元凋亡進行調節，但在該調節軸中，miR-384過表達反而促進神經元凋亡，加重腦損害，與本次結論相悖。分析原因可能為上述研究以小鼠為模型，而本研究以新生兒為研究對象。miR-384還可能通過減少腦組織內炎性巨噬細胞，從而減少腦內丙二醛、過氧化氫酶和超氧陰離子陽性細胞數量，減輕局部炎癥，對腦組織進行保護[19]。而炎癥與HIE發生密切相關，大量炎癥介質的釋放會加重HIE嚴重程度，miR-384低表達則可能通過促炎作用，加速HIE發生與進展。

本研究發現HIE患兒的血清Treg下降，Th17、Th17/Treg增高，表明Th17/Treg參與了該病發生過程。Treg具有抗炎功能，能對自身免疫反應進行抑制，在限制炎癥、維持免疫穩定性中發揮重要作用。Th17則具有促炎作用，它能通過調節核轉錄因子-kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)信號路徑，促進炎癥介質產生。腦損傷患者可見Th17/Treg失衡，具體表現為Th17及其細胞因子含量上升，而Treg及其細胞因子含量下降，Th17/Treg失衡可通過調節相關的炎癥信號通路，促進腦損傷[20]。

3.3 miR-38表達與HIE患兒炎癥、Th17/Treg失衡、NBNA評分的關系

本研究顯示隨著HIE臨床分度增加，患兒的促炎因子表達水平逐漸升高，而血清miR-384水平、抗炎因子表達水平逐漸下降，且NBNA評分逐漸降低。這表明HIE患兒病情加重與炎癥反應程度及神經行為能力水平有關。患兒機體組織中的炎癥程度越重，則可導致腦損害進一步加劇，進而影響神經行為功能，經之前的分析提示血清miR-384在腦損傷中能發揮抗炎作用，而低表達的miR-384可能無法對腦內炎性巨噬細胞進行充分調節，促進神經炎癥，加重中樞神經毒性，致腦損害進展，上述作用可能共同導致HIE病情加重。本研究提示HIE患兒血清miR-384與炎癥因子、Th17、Treg、NBNA評分均有相關性，這進一步提示miR-384可能通過與炎癥因子、Th17、Treg相互作用，參與HIE進展。miR-384可能通過減少炎性巨噬細胞、下調促炎介質水平發揮抗炎功能，對腦組織功能進行保護，而一旦miR-384表達下調，則可能致炎性巨噬細胞數量增加，促炎介質釋放增多，導致與Th17相關的促炎因子大量釋放，機體抗炎作用減弱，Treg相關抗炎因子水平下調，促使Th17/Treg失衡。

綜上所述，HIE患兒血清miR-384水平下調，且其可能與炎癥因子、Th17、Treg共同影響HIE患兒病情有關，臨床有望通過檢測血清miR-384水平輔助評估HIE患兒病情。本研究局限性為受研究時間限制，未進一步隨訪觀察miR-384對HIE患兒遠期腦發育是否有影響，日后將增設隨訪對此予以探討。