超聲處理對牙本質(zhì)玷污層性狀及粘接強度的影響

王如玉，潘雅慧，聶蓉蓉，孟翔峰

在口腔修復(fù)領(lǐng)域，牙本質(zhì)粘接一直以來都是研究的熱點和難點，其粘接效果受許多因素影響[1]。其中牙本質(zhì)在打磨過程中產(chǎn)生的玷污層是影響粘接強度的重要因素之一[2]，所以玷污層的預(yù)處理方式也是歷代粘接劑改良的重點[3]。目前運用廣泛的通用型樹脂粘接劑通常屬于弱酸型，它無法徹底去除牙本質(zhì)表面的玷污層，只能部分溶解或改性，尤其是超弱酸型粘接劑作用的深度僅為幾百納米[4-5]，幾乎無法在粘接界面形成樹脂突，所以牙本質(zhì)表面玷污層的性狀會極大地影響其粘接效果。

超聲技術(shù)是現(xiàn)代口腔治療中一種有效的清潔方式。在牙周領(lǐng)域，其通過高頻振蕩和在水中產(chǎn)生的空穴效應(yīng)去除菌斑牙石等附著物[6-7]；在牙體牙髓領(lǐng)域，通過超聲蕩洗可以去除根管內(nèi)壁附著的玷污層及殘留細(xì)菌等[8]。受此啟發(fā)，如果在牙體預(yù)備后輔助使用超聲器械處理牙體表面玷污層，也許有助于提高弱酸型通用樹脂粘接劑與牙本質(zhì)間的粘接強度。因此本研究采用了弱酸型和超弱酸型兩種不同的通用型樹脂粘接劑，旨在探究超聲處理對離體牙牙體預(yù)備后表面玷污層性狀以及粘接強度的影響，為進一步臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本院口腔頜面外科門診收集的新鮮拔除的40顆無齲下頜第三磨牙(去除附著軟組織，經(jīng)消毒處理后保存在4 ℃生理鹽水中，1個月內(nèi)使用)；320目碳化硅砂紙(鷹牌，香港瑞新行有限公司，中國)；2種通用型樹脂粘接劑：All-Bond Universal (pH=3.1，Bisco，美國)，Clearfil Universal Bond (pH=2.3，Kuraray，日本)；光固化復(fù)合樹脂Z350(3M，美國)；自凝牙托粉及牙托水(滬鴿，中國)；Rhodamine B(Sigma，美國)；氰基丙烯酸酯粘接劑(Alteco，日本)。

1.2 實驗設(shè)備

LED光固化燈(EliparTMDeepCure-S，3M，美國)；慢速切割機(Isomet 1000，標(biāo)樂，美國)；超聲潔牙機(Piezon Master 700，EMS，瑞士)；C尖(Piezon System，EMS，瑞士)；掃描電子顯微鏡(JEM-200CX，JEOL，日本)；激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM800，ZEISS，德國)；體視顯微鏡(SMA1500，Nikon，日本)；微拉伸測試儀(T-61010K，Bisco，美國)；電子游標(biāo)卡尺(JEM-200CX，上海精密儀器儀表公司，中國)；37 ℃生化培養(yǎng)箱(SPX-80，上海博泰實驗設(shè)備有限公司，中國)。

1.3 牙本質(zhì)表面玷污層的制備

將40顆離體牙以近中頰軸角釉牙骨質(zhì)界與近中頰尖連線的上1/2處為切割點，在水流冷卻條件下利用慢速切割機垂直牙體長軸切割暴露牙本質(zhì)。體視顯微鏡下確認(rèn)表面無釉質(zhì)殘留后，將40顆離體牙用320目碳化硅砂紙流水下打磨30 s，隨機選擇其中一半的離體牙繼續(xù)用超聲潔牙機C尖(水流速度40 mL/min，頻率32 kHz)處理牙本質(zhì)表面，工作尖與牙面輕接觸無壓力，確保超聲充分且無重復(fù)，移動速度1 mm/s。處理結(jié)束后，用氣槍以水噴霧方式徹底清洗牙本質(zhì)表面后備用(實驗流程見圖1)。

圖1 實驗方法簡略圖

1.4 掃描電子顯微鏡(SEM)觀測牙本質(zhì)表面玷污層性狀

分別從320目碳化硅砂紙打磨組及超聲處理組中隨機選取離體牙，利用慢速切割機垂直于牙體長軸切割形成2 mm厚度的牙本質(zhì)薄片，固定、脫水、干燥，離子濺射器噴金后粘臺，用SEM觀察牙本質(zhì)表面玷污層性狀差異。每組隨機選取3張2 000倍電鏡照片，利用ImageJ軟件對圖片中牙本質(zhì)小管暴露情況進行量化分析：牙本質(zhì)小管完全暴露或暴露3/4以上評分為1.00，暴露1/2～3/4評分為0.75，暴露1/4～1/2評分為0.50，暴露1/4以下評分為0.25。利用此方法來客觀評價牙本質(zhì)小管暴露情況。

1.5 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀測粘接界面樹脂滲透情況

Rhodamine B是由電中性、非游離分子組成的熒光染料，極易溶解于有機溶劑，能夠在粘接劑中均勻分布，從而獲得良好的熒光成像效果[9]，可以直觀地對樹脂突的數(shù)目與長度進行觀測，并且不會對樹脂粘接效果產(chǎn)生影響。將Rhodamine B(1 g/L)分別溶解于2種粘接劑中(Clearfil Universal Bond和All-Bond Universal)。從320目碳化硅砂紙打磨組及超聲處理組中隨機選取離體牙，按產(chǎn)品說明書要求分別用上述已制備好的粘接劑與復(fù)合樹脂Z350進行粘接。粘接過程如下：將牙本質(zhì)表面用水噴霧徹底清洗，氣槍輕吹去除多余水分(不要完全干燥)，在牙本質(zhì)表面反復(fù)均勻涂布粘接劑15 s，氣槍吹至表面看不見流動的粘接劑，光照10 s后，分層堆塑復(fù)合樹脂(Z350)，形成厚度為4 mm的樹脂層，光照20 s，完成固化。粘接好的離體牙儲存在37 ℃蒸餾水中。24 h后用慢速切割機將各組粘接好的離體牙沿頰舌向垂直于粘接界面切開，切成1.0 mm厚的薄片，用LSCM觀察各試件粘接界面的微觀形態(tài)。

1.6 樣本粘接

分別將320目碳化硅砂紙打磨組(320目)及超聲處理組(320目+C尖)隨機分為2組，按產(chǎn)品說明書要求分別用All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond粘接復(fù)合樹脂Z350。實驗組最終分為4組即All-Bond (320目，320目+C尖)，Clearfil (320目，320目+C尖)。粘接過程如步驟1.5中所述。粘接好的離體牙儲存在37 ℃蒸餾水中備用。

1.7 切割試件

利用慢速切割機將各組粘接好的離體牙切割成長方體形微拉伸試件，粘接面積約1.0 mm×1.0 mm，試件長度需≥8.0 mm(圖1)。體視顯微鏡下排除有裂紋及粘接界面有釉質(zhì)的試件后，儲存在37 ℃蒸餾水中。

1.8 微拉伸粘接強度測試

利用電子游標(biāo)卡尺測量試件粘接界面處的厚度(a)和寬度(b)，計算粘接面積(S=a×b)。將微拉伸試件粘固在微拉伸測試儀上，保持加載頭與試件長軸在同一直線上，設(shè)置加載速度為0.5 mm/min，直至試件粘接界面斷裂，此時得到最大載荷力F。微拉伸粘接強度=最大載荷力÷粘接面積。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 23.0軟件，使用雙因素方差分析(two-way analysis of variance)對牙本質(zhì)表面處理方式和樹脂粘接劑類型進行分析，并判斷兩者的交互作用。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電子顯微鏡結(jié)果

SEM結(jié)果顯示(圖2)，經(jīng)過320目碳化硅砂紙打磨后牙本質(zhì)表面玷污層劃痕明顯，牙本質(zhì)小管幾乎完全被碎屑堵塞，未見明顯牙本質(zhì)小管暴露；而經(jīng)過C尖超聲處理之后，牙本質(zhì)表面玷污層劃痕不明顯，可見大量牙本質(zhì)小管暴露。對放大2 000倍的電鏡圖片進行量化分析，統(tǒng)計牙本質(zhì)小管暴露評分之和，結(jié)果顯示超聲處理后牙本質(zhì)小管暴露評分明顯增加(P<0.01)。

A：牙本質(zhì)表面掃描電子顯微鏡圖;B：牙本質(zhì)小管暴露評分，**：P<0.01

2.2 樹脂滲透結(jié)果

粘接劑向牙本質(zhì)小管內(nèi)滲透形成的樹脂突性狀對粘接強度影響顯著，所以本實驗檢測了經(jīng)過不同方法處理之后的牙本質(zhì)表面樹脂滲透情況。由圖3可見，相比單純的320目碳化硅砂紙打磨，經(jīng)過C尖超聲處理過后的粘接劑滲透形成的樹脂突更多更長，表現(xiàn)在紅色熒光沿牙本質(zhì)小管更加滲透入牙本質(zhì)深部。

圖3 樹脂滲透的激光共聚焦顯微鏡觀察 ( ×40)

2.3 微拉伸粘接強度測試

所有實驗組的微拉伸粘接強度結(jié)果見表1。All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond的320目+C尖組的粘接強度均顯著高于各自的320目砂紙打磨組(P<0.05)。相同的牙本質(zhì)表面處理條件下，All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond的粘接強度無顯著差異。

表1 通用型樹脂粘接劑微拉伸粘接強度

3 討 論

在牙本質(zhì)打磨切割過程中不可避免會有玷污層的產(chǎn)生，它是一層由變性有機物和無機物碎屑混合血液、唾液及牙本質(zhì)小管滲出液形成的不定型結(jié)構(gòu)[10]，如圖2所示，牙體預(yù)備后，厚而粗糙的玷污層會直接堵塞牙本質(zhì)小管，常規(guī)用氣槍進行水噴霧沖洗，并不能對玷污層的去除產(chǎn)生積極作用。有研究證明在自酸蝕粘接系統(tǒng)中，較厚的玷污層會中和粘接劑中的酸性單體，從而影響粘接劑向牙本質(zhì)小管的滲透，降低粘接強度[2]。

當(dāng)通用型樹脂粘接劑采用酸蝕-沖洗方式，可以通過強酸完全去除表面玷污層，提高粘接強度，但面臨著與傳統(tǒng)酸蝕-沖洗方式相同的弊端即術(shù)后敏感、技術(shù)敏感性高等[11]。而通用型樹脂粘接劑采用自酸蝕粘接模式相當(dāng)于傳統(tǒng)的一步法自酸蝕粘接劑，大多屬于弱酸型(pH≈2)和超弱酸型(pH≥2.5)[12]，故本研究納入了兩種粘接劑分別為弱酸型(Clearfil Universal Bond)和超弱酸型(All-Bond Universal)，探究超聲處理對不同pH值通用型樹脂粘接劑粘接效果的影響。如圖3所示，未經(jīng)超聲處理的樹脂粘接界面無明顯的樹脂突形成，因為玷污層會中和粘接劑中的酸性單體，使得弱酸型通用樹脂粘接劑對下方牙本質(zhì)表面脫礦不足，阻礙其向牙本質(zhì)小管的滲透以及樹脂突的形成[13]。這說明雖然pH的提高使得通用型樹脂粘接劑應(yīng)用更加安全，但同時也存在對玷污層溶解不夠、粘接強度低等問題[14]。提示通用型樹脂粘接劑的自酸蝕粘接模式需要尋找一種有效的方法來處理牙本質(zhì)表面玷污層，從而提高粘接性能。

超聲器械作為牙周科以及牙體牙髓病科臨床的常用器械，利用高頻振蕩以及空穴效應(yīng)可以去除牙石、菌斑以及根管內(nèi)殘留的細(xì)菌和玷污層[15-16]。同時相對于可能會導(dǎo)致牙本質(zhì)燒焦或者融化的激光處理，超聲通過聲波介導(dǎo)的能量相對較小且安全，在輕接觸無壓力的正確操作下，不會對牙本質(zhì)內(nèi)部造成傷害[17]。同時超聲潔牙尖具有多種型號可選，C尖具有較寬的工作尖，可以增加接觸面積，提升清潔效率，減小對牙面的損傷[18]。基于此理論基礎(chǔ)，本研究利用超聲器械對牙本質(zhì)打磨后產(chǎn)生的玷污層進行處理，發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠部分去除玷污層，暴露其下方牙本質(zhì)小管(如圖2A所示)。暴露的牙本質(zhì)小管，有利于粘接劑對牙本質(zhì)小管內(nèi)部的滲透，并且牙本質(zhì)表面未見明顯損傷痕跡，提示C尖超聲處理方式的安全性。如圖3所示，本研究中利用Rhodamine B對粘接劑進行染色，清楚地顯示了經(jīng)過超聲處理后粘接劑向牙本質(zhì)深處滲透得更多更長。超聲的機械蕩洗作用，使得玷污層被去除或者變薄，從而有利于通用型樹脂粘接劑的滲透，形成更多更長的樹脂突，為提高牙本質(zhì)樹脂粘接強度創(chuàng)造了條件。

微拉伸強度結(jié)果(表1)顯示經(jīng)過C尖超聲處理的牙本質(zhì)表面，其與2種通用型樹脂粘接劑間的粘接強度均得到顯著提高。表1中還顯示All-Bond Universal 和Clearfil Universal Bond(pH=3.1vs. pH=2.3)間粘接強度無統(tǒng)計學(xué)差異。所以pH值不是決定自酸蝕粘接劑性能的唯一因素，更為重要的是粘接劑的組成成分，尤其是酸性單體的種類和濃度等[19]。通用型樹脂粘接劑向牙本質(zhì)小管的更深滲透，形成更長的樹脂突，一方面增加了粘接劑與牙本質(zhì)表面間的機械結(jié)合力，另一方面，通過擴大接觸面積，提高了通用型樹脂粘接劑與牙本質(zhì)表面間的化學(xué)結(jié)合力。本研究利用的通用型樹脂粘接劑均含有酸性功能單體10-甲基丙烯酰氧癸基磷酸酯(10-MDP)。10-MDP含有磷酸基團，在氫離子的攻擊下，牙本質(zhì)表面淺層脫礦，10-MDP的磷酸基可與牙體中羥基磷灰石晶體(HAP)的鈣離子形成穩(wěn)定的結(jié)合[20]。超聲處理暴露了牙本質(zhì)小管口，有利于粘接劑向牙本質(zhì)小管的滲透，在提高機械固位的同時，也擴大了與牙本質(zhì)表面接觸面積，實現(xiàn)10-MDP與更多的HAP鈣離子產(chǎn)生化學(xué)結(jié)合，從而優(yōu)化了通用型樹脂粘接劑的雙重粘接機制即“機械固位”和“化學(xué)結(jié)合”，顯著提高粘接強度[21-22]。

本研究通過體外實驗初步探究了超聲處理對牙本質(zhì)表面玷污層的影響，證實了超聲振蕩能夠部分去除玷污層，暴露牙本質(zhì)小管，增加通用型樹脂粘接劑的滲透深度以及粘接強度，是一種具有臨床應(yīng)用潛能的方法。