全長脂聯素在高糖環境下對結腸癌細胞增殖與凋亡的影響

葉 帥，季 華，趙曉彤，許慕蓉，陳明衛

薈萃分析表明，糖尿病患者中結直腸癌(colorectal cancer，CRC)發病風險增加近30%[1]。脂聯素是脂肪組織特異性分泌的脂肪因子，具有調節葡萄糖和脂肪代謝、抗炎和抗動脈粥樣硬化、負性調節免疫系統等作用。其在2型糖尿病(T2DM)患者中水平顯著降低，與T2DM發病密切相關[2]。近年來研究[3-4]顯示，血漿脂聯素濃度的降低可增加CRC的患病風險。目前臨床研究尚不能確定脂聯素是否為聯系糖尿病和CRC發病之間的一個關鍵因素。有關脂聯素在高糖環境下對結腸癌細胞的影響也尚不清楚。該研究模擬糖尿病的高糖環境，用多種濃度脂聯素刺激結腸癌細胞株，觀察增殖、凋亡的變化，以期為今后的結腸癌診斷和治療找到新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料人結腸癌細胞株SW480(中科院上海細胞庫)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮噻唑蘭(MTT)、胰酶消化液、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公司)；SB203580(美國Santa Cruz公司);全長脂聯素(美國R&D公司)；Western細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)。

1.2SW480結腸癌細胞培養用含10%胎牛血清、葡萄糖含量為4.5 g/L的DEME培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養人SW480結腸癌細胞，1～2 d更換培養液，待細胞生長至85%融合時傳代。細胞傳代2次以上進行后續實驗。實驗所用細胞均處對數生長期。

1.3實驗分組觀察不同濃度f-APN對在高糖環境下培養的SW480結腸癌細胞增殖、凋亡的影響，并探討p38MAPK信號通路在f-APN發揮效應中的作用，實驗分為6組：高糖對照組(0 μg/ml f-APN+高糖，即用葡萄糖含量為4.5 g/L的DEME培養基)、APN1組(10 μg/ml f-APN+高糖)、APN2組(20 μg/ml f-APN+高糖)、APN3組(30 μg/ml f-APN+高糖)、APN+SB組(30 μg/ml f-APN+高糖+10 μmol/L p38MAPK阻滯劑SB203580)、低糖對照組(低糖，葡萄糖含量為1.0 g/L的DEME培養基)。

1.4MTT法檢測SW480結腸癌細胞的增殖情況將生長至對數生長期的SW480結腸癌細胞消化后收集細胞，以每孔6×104個細胞均勻鋪在96孔板中，每孔100 μl DMEM培養基，按分組條件干預24 h、48 h后，每孔加20 μl MTT(濃度為5 mg/ml)，避光孵育4 h，小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μl DMSO，酶標儀490 nmol/L波長檢測OD值。

1.5流式細胞儀檢測SW480結腸癌細胞凋亡情況胰酶消化對數生長期的SW480結腸癌細胞后收集細胞，以每孔1×106個細胞均勻鋪在6孔板中，按分組條件干預細胞24 h、48 h后，依次預冷的PBS洗滌、離心15 min(4 ℃、1 000 r/min)、固定細胞(75%乙醇，冰預冷)、流式細胞儀測凋亡率、Cell Quest軟件分析。

1.6Westernblot測定f-APN干預后p-p38MAPK、Caspase-3蛋白的表達胰酶消化SW480細胞，以每孔106個細胞均勻鋪在6孔板中，再按分組條件分別干預24 h、48 h后，依次進行提細胞總蛋白并測濃度、SDS-PAGE電泳(濃縮膠55 V、30 min,分離膠110 V、 60 min)、轉膜(280 mA，恒流75 min)、封閉(5%脫脂牛奶，3 h)、一抗孵育(β-actin，1 ∶1 000；Caspase-3，1 ∶1 000；p-p38MAPK，1 ∶1 000；4 ℃過夜)、二抗孵育(5%脫脂牛奶：二抗，1 ∶1 600；孵育45 min)、顯影。Quantity One凝膠成像軟件分析相對灰度值。

2 結果

2.1f-APN在高糖環境下對SW480細胞增殖的影響MTT結果顯示，與低糖對照組比較，24 h、48 h后高糖對照組OD值均顯著升高(P<0.05)。干預24 h后，與高糖對照組、APN1組、APN2組比較，APN3組OD值均顯著降低(P<0.05)。干預48 h后，與低糖對照組比較，高糖對照組OD值顯著升高(P<0.05)；與高糖對照組比較，APN1組、APN2、APN3組OD值均顯著降低(P<0.05)；APN2、APN3組OD值較APN1組更低，APN3組OD值低于APN2組(P<0.05)，見表1。

表1 不同時間、不同濃度的f-APN對SW480細胞增殖活性的影響

2.2高糖環境下f-APN對SW480細胞凋亡的影響應用流式細胞儀檢測顯示，24 h后低糖對照組、高糖對照組、APN1組、APN2組、APN3組的細胞凋亡率分別為(3.92±0.63)%、(3.89±0.79)% 、(4.94±0.85)%、(7.43±2.67)%、(8.67±2.75)%。與低糖對照組比較，高糖對照組細胞凋亡率差異無統計學意義。干預24 h后，與高糖對照組比較，APN3組的細胞凋亡率明顯增加(F=32.185，P<0.05)，見圖1。而48 h后低糖對照組、高糖對照組、APN1組、APN2組、APN3組的細胞凋亡率分別為(4.01±0.75)%、(3.96±0.92)% 、(6.21±1.31)%、(8.86±2.83)%、(9.47±3.15)%。與低糖對照組比較，高糖對照組細胞凋亡率差異無統計學意義。干預48 h后，與高糖對照組比較，APN1組、APN2組、APN3組細胞凋亡率均上升，但差異無統計學意義(F=58.193，P<0.05)。APN2組、APN3組的細胞凋亡率較APN1組更高，APN3組的細胞凋亡率高于APN2組(F=58.193，P<0.05)，見圖2。

2.3高糖環境下f-APN對Caspase-3、p-p38MAPK蛋白表達的影響與高糖對照組比較，隨著f-APN濃度的增加，p-p38MAPK以及Caspase-3蛋白表達均呈明顯增高趨勢。與高糖對照組比較，APN2組、APN3組的p-p38MAPK蛋白表達明顯增高，APN3組的p-p38MAPK蛋白表達較APN2組更高，APN+SB組p-p38MAPK蛋白表達低于APN3組，差異均有統計學意義(F=7.741，P<0.05)，見圖3。與高糖對照組比較，APN1組Caspase-3蛋白蛋白表達升高，但差異無統計學意義，APN2組、APN3組的Caspase-3蛋白蛋白表達明顯增高，APN3組的Caspase-3蛋白蛋白表達較APN2組更高，APN+SB組Caspase-3蛋白表達低于APN3組，差異均有統計學意義(F=6.829，P<0.05)，見圖3。

圖1 流式細胞儀檢測24 h后細胞凋亡A:低糖對照組;B:高糖對照組;C:APN1組;D:APN2組;E:APN3組

圖2 流式細胞儀檢測48 h后細胞凋亡A:低糖對照組;B:高糖對照組;C:APN1組;D:APN2組;E:APN3組

圖3 f-APN對p-p38MAPK、Caspase-3蛋白表達的影響

1：高糖對照組；2：APN+SB組；3：APN1組；4：APN2組；5：APN3組

3 討論

糖尿病是以慢性高血糖為顯著特征的代謝性疾病。大量流行病學調查顯示，糖尿病患者中包括結腸癌在內的多種腫瘤患病風險顯著增加，其具體機制目前尚未闡明。由于葡萄糖是腫瘤細胞的唯一能量來源，因此普遍認為高血糖可能是促進腫瘤發病的重要危險因素之一。本研究顯示SW480細胞在高塘環境下增殖活性明顯增高，也表明了增高的血糖濃度可以促進腫瘤細胞的生長。

脂聯素是脂肪組織特異性分泌的表達最豐的激素，其隨著脂肪體積增大而在血液中濃度降低。近年來有研究顯示，脂聯素水平的降低增加了多種腫瘤的發病風險，包括本課題組前期研究在內的多項研究[2-3]均顯示，血漿脂聯素濃度的降低可增加CRC的患病風險。為探究脂聯素是否為糖尿病患者(伴隨脂聯素水平降低)CRC發病風險增加的獨立危險因素。因此，在體外高糖環境下應用不同濃度的脂聯素干預結腸癌細胞株，將有助于更清晰地闡明脂聯素在糖尿病并發CRC過程中的作用。本實驗結果顯示，在高糖環境下，f-APN對SW480細胞增殖抑制作用以及促凋亡效應與f-APN濃度以及作用時間密切相關。隨著f-APN作用時間的延長、濃度的升高，其抑制SW480細胞增殖以及促進SW480細胞凋亡效應增強。提示f-APN以濃度、時間依賴方式抑制SW480細胞的增殖，誘導細胞凋亡。這與Nigro et al[5]在其他結腸癌細胞系Caco-2、HCT116中的研究結果一致。與此同時，也有作者研究了脂聯素和其他腫瘤細胞的關系，如人乳腺癌MCF-7細胞[6]、胃癌HGC27[7]，本實驗對SW480細胞的結果與之一致，這也從另一方面解釋了糖尿病患者惡性腫瘤發生風險增加的原因。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在信號傳遞途徑中(包括ERK、JNK和p38MAPK等蛋白激酶信號途徑)有重要作用。脂聯素可通過增加腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化的方式使裂原活化蛋白激酶(MAPK)發揮作用，p38MAPK被認為是MAPK多級蛋白激酶信號轉導系統中主要成員之一，通常被認為是介導細胞凋亡的蛋白激酶。Duarte et al[8]研究發現，p38MAPK以非磷酸化形式存在于細胞質內(當細胞在受到體內外各種刺激因素，如致炎癥因子、缺血低氧等刺激后)，p38MAPK轉化為磷酸化形式而具有活性，而后進入細胞核內磷酸化核轉錄因子，從而調節基因轉錄，可激活 Caspase家族成員，引起細胞增殖、分化、凋亡及細胞因子的合成，誘導p38-caspase-3 促凋亡通路。有研究[9]表明Caspase-3在結直腸癌旁正常組織中的表達水平顯著高于癌組織，且Caspase-3表達與CRC分期和病理分級有關。本研究結果顯示，在高糖環境下，f-APN以濃度依賴方式上調p-p38MAPK蛋白以及Caspase-3蛋白表達，推測f-APN抑制SW480細胞的增殖，促進其凋亡的機制可能與其對p38MAPK信號通路的刺激作用以及增加活性Caspase-3蛋白表達有關。此外，本研究顯示，在應用f-APN干預過程中，p38MAPK激活與Caspase-3活化之間可能存在級聯關系，p38MAPK激活可導致Caspase-3蛋白表達增加。有研究[10]顯示p38MAPK/Caspase-3依賴的信號通路在介導結腸癌細胞凋亡中具有重要作用。

綜上所述，f-APN在高糖環境下以濃度、時間依賴方式抑制SW480細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與p38MAPK通路的激活和Caspase-3的活化有關。