甘草酸對感染人巨細(xì)胞病毒的人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響

沈利霞, 蘇賢鳳

(四川省廣安市人民醫(yī)院 藥劑科, 四川 廣安, 638000)

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的病毒感染因子[1]。研究[2-3]表明, HCMV是先天性感染的主要病原體之一，發(fā)展中國家成年人和大齡兒童的感染率高達(dá)95%左右，感染可累及肝、腎、肺、腸等臟器，健康人一般表現(xiàn)為潛伏感染或無癥狀的亞臨床感染，但在免疫缺陷綜合征、器官移植患者和新生兒等免疫功能低下人群中，HCMV感染常引起嚴(yán)重的多系統(tǒng)病變，甚至造成死亡。甘草酸是中藥甘草根部的提取物，是甘草最主要的活性成分，可溶于水，味甜，可用作調(diào)味劑、甜味劑和香味增強(qiáng)劑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[4]表明，甘草酸具有抗氧化、抑菌、消炎、抗病毒等多種生物活性。另有研究[5]表明，甘草酸具有抗HCMV的效應(yīng)。細(xì)胞凋亡是HCMV感染致病的重要機(jī)制之一，而HCMV感染宿主細(xì)胞后還可與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等促炎信號分子產(chǎn)生，引發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)，為其自身復(fù)制和傳播創(chuàng)造有利的微環(huán)境[6]。本研究探討甘草酸對感染HCMV的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)情況的影響，以期為甘草酸在抗HCMV中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HCMV AD169株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC); 人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; 注射用更昔洛韋購自武漢長聯(lián)來福制藥股份有限公司，0.25 g/瓶，批號H20066700; 甘草酸購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，20 mg/支，批號20140818; CCK8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司; 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技股份有限公司; 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)一抗、活化Caspase3(Cleaved-caspase3)一抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、IL-6一抗、TNF-α一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素與鏈霉素雙抗的MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化離心，進(jìn)行傳代。

1.3 病毒感染及分組

取對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞，加入胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中。將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，即對照組、病毒組、更昔洛韋組(50 μg/mL, 陽性對照組)、甘草酸低劑量組(0.25 mg/mL)、甘草酸中劑量組(0.50 mg/mL)、甘草酸高劑量組(1.00 mg/mL)[6]。對照組用未處理培養(yǎng)液培養(yǎng)，其余5組先用接種100 TCID50劑量AD169毒株的培養(yǎng)液培養(yǎng)1.5 h, 然后更換含有對應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置9個(gè)復(fù)孔。所有細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性

取生長至對數(shù)期的MRC-5細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后用培養(yǎng)基稀釋為密度1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后接種于96孔板中，每孔200 μL, 待細(xì)胞貼壁后，按上述分組接種病毒和相應(yīng)藥物，放置于含有5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1.5 h后更換培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)向每孔加入20 μL的CCK8溶液孵育4 h, 然后在酶標(biāo)儀上檢測每孔的光密度(OD)值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

取對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成密度為3×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按上述分組接種病毒和相應(yīng)藥物，在含有5%CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 1.5 h后更換培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)加入胰酶消化細(xì)胞，重懸細(xì)胞并調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL, 在流式管中加入細(xì)胞懸液100 μL、Annexin V-FITC染液5 μL、PI溶液5 μL, 避光染色30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算總凋亡率。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)

于各組細(xì)胞經(jīng)HCMV感染后48 h收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白樣本煮沸變性，然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜在含5%脫脂奶粉的封閉液中固定2 h，然后分別與Caspase3(1∶1 000)、Cleaved-caspase3(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗稀釋液于4 ℃下孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶2 000)于室溫下孵育2 h, 最后于ECL試劑中避光顯色，凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照。使用凝膠圖片處理軟件Image J分析目的蛋白條帶的灰度值，并計(jì)算Cleaved-caspase3和Caspase3總蛋白(Total-caspase3)相對表達(dá)量。

1.7 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子水平

于各組細(xì)胞經(jīng)HCMV感染24、48、72 h時(shí)，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用ELISA試劑盒檢測上清液中TNF-α、IL-6水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 甘草酸對感染HCMV的MRC-5細(xì)胞增殖活性(OD450 nm)的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)HCMV感染24 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 經(jīng)HCMV感染48、72 h時(shí)，病毒組細(xì)胞的增殖活性均低于對照組，更昔洛韋組、甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組細(xì)胞的增殖活性均高于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 甘草酸低劑量組與病毒組比較，甘草酸中劑量組與甘草酸高劑量組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。因此，本研究選擇甘草酸中劑量組(0.50 mg/mL)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并簡稱甘草酸組。

表1 HCMV感染后不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞增殖活性比較

2.2 甘草酸對感染HCMV的MRC-5細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，經(jīng)HCMV感染24 h時(shí)，各組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 經(jīng)HCMV感染48、72 h時(shí)，病毒組MRC-5細(xì)胞的凋亡率均高于對照組，更昔洛韋組、甘草酸組MRC-5細(xì)胞的凋亡率均低于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測HCMV感染后不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

表2 HCMV感染后不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞總凋亡率比較 %

2.3 甘草酸對感染HCMV的MRC-5細(xì)胞Caspase3表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)HCMV感染48 h后，病毒組MRC-5細(xì)胞Cleaved-caspase3蛋白相對表達(dá)量高于對照組，更昔洛韋組、甘草酸組MRC-5細(xì)胞Cleaved-caspase3蛋白相對表達(dá)量低于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 各組細(xì)胞Total-caspase3相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖2。

2.4 甘草酸對HCMV感染的MRC-5細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，經(jīng)HCMV感染24、48、72 h時(shí)，病毒組MRC-5細(xì)胞TNF-α、IL-6水平均高于對照組，更昔洛韋組、甘草酸組MRC-5細(xì)胞的TNF-α、IL-6水平均低于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 各組細(xì)胞Cleaved-caspase3和Total-caspase3蛋白相對表達(dá)量比較

A: Western blot檢測結(jié)果; B: Cleaved-caspase3和Total-caspase3表達(dá)情況(與對照組比較, *P<0.05; 與病毒組比較, #P<0.05)。圖2 Western blot檢測細(xì)胞中Cleaved-caspase3和Total-caspase3蛋白表達(dá)情況

Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)HCMV感染48 h后，病毒組MRC-5細(xì)胞TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，更昔洛韋組、甘草酸組MRC-5細(xì)胞TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量均低于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖3。

表4 HCMV感染后不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平比較 pg/mL

表5 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

HCMV是一種皰疹病毒組DNA病毒，分布廣泛，成人感染率極高，感染主要累及肺、肝、腸等臟器，對于免疫缺陷綜合征患者、新生兒及器官移植者而言, HCMV感染可引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至導(dǎo)致死亡[7]。研究[8]表明, HCMV感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡，并抑制宿主細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡是在生理?xiàng)l件下由基因控制的程序性細(xì)胞死亡，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用[9]。因此，尋找針對HCMV的新型抗病毒藥物依然是病毒學(xué)研究中的重要任務(wù)。甘草酸是一種廣譜抗冠狀病毒候選物，具有抗病毒、抗氧化、抗炎、保護(hù)肝臟等多種生物活性[10], 目前已被普遍使用于臨床。相關(guān)研究[11-12]表明，甘草酸具有優(yōu)異的抗病毒活性，能夠通過阻礙病毒與宿主細(xì)胞相互作用而阻斷嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的感染，且甘草酸與綠原酸聯(lián)合用藥能夠?qū)粑篮习《?RSV)產(chǎn)生較好的抑制作用。本研究通過CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)對甘草酸作用下MRC-5細(xì)胞增殖和凋亡情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HCMV感染24 h時(shí)，細(xì)胞增殖和凋亡情況均無明顯變化，但感染48 h后細(xì)胞增殖活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，而甘草酸能夠有效促進(jìn)感染HCMV的MRC-5細(xì)胞增殖，抑制HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，作用與更昔洛韋一致。

A: Western blot檢測結(jié)果; B: TNF-α和IL-6表達(dá)情況(與對照組比較, *P<0.05; 與病毒組比較, #P<0.05)。圖3 Western blot檢測各組細(xì)胞中TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)情況

Caspase3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶, Caspase3的活化在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用[13]。本研究檢測HCMV感染48 h時(shí)細(xì)胞中Total-caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果與細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果一致。病毒需要利用宿主細(xì)胞完成其自身的復(fù)制和增殖，因此感染早期是通過阻止Caspase3的活化而阻止宿主細(xì)胞凋亡，感染后期則是通過活化Caspase3誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡而使其發(fā)生致病效應(yīng)。HCMV原發(fā)感染多為無癥狀的潛伏感染，通常可被機(jī)體免疫系統(tǒng)有效控制而不致病，但當(dāng)機(jī)體免疫功能降低時(shí)，病毒再激活，可引起機(jī)體多器官炎癥反應(yīng)及功能障礙。研究[14-15]表明，HCMV在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖復(fù)制，可導(dǎo)致TNF-α和IL-6等炎性因子表達(dá)，引起炎癥性疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), HCMV在感染MRC-5細(xì)胞24 h時(shí)即可引起細(xì)胞TNF-α、IL-6分泌水平升高，而甘草酸對HCMV感染引起的炎性因子高水平具有抑制作用。

綜上所述，甘草酸能夠促進(jìn)感染HCMV的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖，抑制HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎性反應(yīng)，這為甘草酸應(yīng)用于HCMV感染性肺疾病的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對臨床抗HCMV治療和預(yù)防具有指導(dǎo)意義。但甘草酸對抗HCMV感染引起的人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制及其臨床應(yīng)用效果尚未明確，未來有待進(jìn)一步深入探討。