生物芯片技術在生物醫學研究中的應用進展

徐霽雪, 張博文, 魏鸞葶, 梁辰昊, 吳玉婷, 趙 艷, 李 成

(中國醫科大學, 1. 第一臨床學院, 2. 中英聯合學院, 3. 臨床二系,4. 免疫學教研室, 遼寧 沈陽, 110000)

生物芯片技術是通過微加工和微電子等微縮技術，依靠生物分子間的特異性相互作用，將生化分析集成于同一張芯片表面，建立一個微型的生化分析系統，從而實現對基因、蛋白質等生物分子準確、快速、高通量的檢測[1-2]。盡管全世界范圍內生物芯片產業技術仍處于成長階段，但技術方法已日趨成熟，應用領域也在不斷拓展，現將近年來不同類型生物芯片在生物醫學研究中的應用現狀綜述如下。

1 生物芯片的發展

早在20世紀70年代, Edwin Southern就研究出了以其名字命名的Southern印跡技術，這被視為“生物芯片”在人類科學史上的首次亮相; 20世紀80年代初，“生物芯片”作為分子電子器件被首次提出; 20世紀90年代，隨著人類基因組計劃的出現和分子生物學的發展，以基因芯片為首的生物芯片技術應運而生，這使得進生物芯片技術入了全新的技術時代，也衍生出了如組織芯片、細胞芯片、蛋白質芯片等適用于不同研究目的的多種芯片技術類型[2-3]。目前，世界范圍內參與研制生物芯片的公司已超過100家，其中有7家上市公司在中國，通過結合微刻技術及多種微流結構，生物芯片的種類倍增且具有反應迅速、易于調控與分析、通過集成多種實驗步驟減少干擾等特點。值得一提的是，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的大流行使得生物芯片技術在醫學研究以及快速診斷中的重要性被再次強調[4], 而生物芯片的量產與大規模應用勢必會讓其未來在生物醫學領域中發揮越來越大的價值。

2 生物芯片的分類

生物芯片包含的種類很多，由于不同研究使用生物芯片技術的實驗條件、實驗方法、研究對象和研究目的有所不同，目前主要依據載體材料(硅芯片、玻璃芯片、陶瓷芯片、塑料芯片)、作用方式(主動式芯片、被動式芯片)、功能與用途(生物電子芯片、生物分析芯片)和芯片固定探針(基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織芯片、糖芯片)進行分類[2, 5]。不同種類的芯片各有特點和優勢，例如主動式芯片由于其快速、易操作的特點主要被應用于生物實驗中對樣品多步驟操作的集成簡化，而被動式芯片則由于其高度平行的特點多被用于對大量生物信息的獲取。本文依據芯片固定探針的不同對生物芯片進行分類，并綜述各類型生物芯片在生物醫學研究中的應用進展。

3 生物芯片的應用

3.1 基因芯片的應用

3.1.1 耐藥菌檢測: 基因芯片可在同一時間檢測出多個基因表達的信息，可用于耐藥菌檢測，并為耐藥菌相關疾病的診斷提供依據。FENG G等[6]使用基因芯片技術檢測結核分枝桿菌的2種基因突變，即對利福平耐藥的rpoB突變以及大多數對異煙肼耐藥的katG基因或inhA啟動子發生的突變，以確定結核桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性。該研究團隊以藥敏試驗結果為參考標準，詳細比較了4 148例來自不同級別抗酸桿菌陽性涂片的痰標本的檢測效率，發現基因芯片技術的檢測敏感性很高，可以直接用于臨床標本耐藥結核菌的檢測。

3.1.2 遺傳性疾病的產前診斷: 目前，基因芯片技術已經可以檢測血友病、β-地中海貧血、先天性軟骨發育不全、苯丙酮尿癥等多種遺傳性疾病，還可以實現對遺傳病家譜的分析。2017年，加拿大婦產科醫師學會、加拿大醫學遺傳學學會聯合推薦利用染色體微陣列分析技術(CMA)進行產前診斷以及胎兒丟失評估。薛青霞等[7]對孕中期疑似高風險的1 129例孕婦進行羊水脫落細胞培養后，將基因芯片技術和染色體核型分析聯合應用于產前出生缺陷篩查，發現相較于單獨應用一項技術，聯合應用可以顯著提高檢出率，有益于新生兒疾病的早期診斷和早期干預，為未來更高效且更精準地實施產前出生缺陷篩查提供強有力的技術保障。

3.1.3 腫瘤檢測及抗腫瘤藥物篩選: 基因芯片技術可對腫瘤發生與發展中相關的關鍵性基因進行檢測，這在腫瘤的診斷、分型和抗腫瘤藥物的篩選工作等方面發揮了重要作用。ZHOU L等[8]利用microRNA基因芯片對比分析肝細胞癌組織與正常組織中差異表達的微小RNA(miRNAs), 共鑒定出153個上調miRNAs和206個下調miRNAs, 并通過MCODE插件篩選基因、功能富集分析、蛋白質相互作用(PPI)網絡構建發現FOXO1預計將受到所有20個miRNAs的調控，且證明miRNAs對于肝細胞癌的發生與發展具有重要意義，為研究肝細胞癌治療新靶點提供了理論基礎。

3.1.4 感染性疾病: 目前，基因芯片技術已被應用于病毒、細菌、寄生蟲等致病基因表達、致病性和抗藥機制的研究。黃姍等[9]應用Sanger測序法、熒光聚合酶鏈反應(PCR)和PCR-電化學基因芯片技術對宮頸脫落細胞進行人乳頭瘤病毒核酸檢測，發現基因芯片技術與傳統方法具有良好的一致性，且具有特異性強、陽性檢測值高等優勢，為臨床檢測人乳頭瘤病毒提供了新方法。在針對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染病例的研究中，MCCORD J M等[10]應用基因芯片和轉錄組測序(RNA-seq)技術檢測基因表達水平，發現在內毒素刺激的人肺動脈內皮細胞中編碼細胞因子的36個基因中，紅系衍生的核因子2相關因子(Nrf2)的活化成分PB125?對人肝源性HepG2細胞中ACE2和TMPRSS2mRNA有明顯下調作用，進而抑制SARS-CoV-2激活進入宿主細胞。對重癥COVID-19病例的觀察結果顯示，“細胞因子風暴”強度與病死率呈強相關，而Nrf2的激活或可有效抑制這些COVID-19相關炎性細胞因子的產生，進而顯著降低“風暴”強度，這對于COVID-19的診斷與治療具有重要意義。

3.2 蛋白質芯片的應用

目前，蛋白質芯片技術在醫學檢測方面應用廣泛，例如確定抗原決定簇、鑒定蛋白功能、研究蛋白之間相互作用、蛋白磷酸化、藥物分析、疾病診斷和體液檢測等。

3.2.1 傳染性疾病的快速篩查: 由于具有高通量、高特異性等優勢，蛋白質芯片可用于傳染性疾病的快速篩查和診斷。CHEN F等[11]利用聚乙二醇處理形成了一種特異性吸附表面，并在此基礎上研發了瘧疾表面等離子體共振蛋白質芯片檢測技術，這種技術可對惡性瘧疾的特異性抗體進行檢測，具有無標記、即時、快速等優點，為進一步發展瘧疾分型鑒定蛋白芯片技術奠定了基礎，在瘧疾環境易感人群的快速篩查方面具有重要意義。

3.2.2 代謝性疾病診斷: SUN G H等[12]利用細胞因子抗體芯片對10例急性痛風性關節炎(AGA)患者和10名健康人員血清樣本中的蛋白質組學表達情況進行比較，發現AGA患者特征性表達蛋白如TNF-α受體Ⅱ(TNFRⅡ)、巨噬細胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、白細胞介素-8(IL-8)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等均與健康人員有顯著差異。研究人員進一步通過基因和基因組富集分析確定差異表達蛋白的生物學功能及信號通路，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法驗證60名AGA患者和60名健康受試者的差異表達蛋白，并通過受試者工作特征(ROC)曲線評價差異表達蛋白對AGA患者的診斷價值，最終確定AGA患者TNFRⅡ、MIP-1β、IL-8和GM-CSF這4種差異表達蛋白與AGA的發生發展密切相關，提示蛋白質芯片技術可通過檢測AGA的生物標志物進行AGA風險預測與診斷。

3.2.3 癌癥診斷: 大量研究證明，癌癥患者血清中的自身抗體可用于癌癥診斷，聯合應用自身抗體可以提高癌癥的診斷敏感性。SUN G Y等[13]制備基于食管鱗狀細胞癌(ESCC)驅動基因的蛋白質芯片，最終有效識別出12種新型抗腫瘤相關抗原的自身抗體，其中GNA11、ACVR1B和P53這3個被認為是區分ESCC患者與健康人的重要標志，并可據此構建診斷ESCC的診斷模型。由此表明，蛋白質芯片技術可以有效識別新型抗腫瘤相關抗原的自身抗體，這對于探索癌癥診斷新方法具有重要意義。

3.2.4 過敏反應檢測: 既往過敏性疾病的檢測多使用過敏原提取物，但由于來源材料和生產過程不一致，結果常有很大差異。目前，蛋白質芯片技術可對血清中的免疫球蛋白E(IgE)進行檢測，同時篩選100多種可疑蛋白質過敏原，相較于先前的過敏原提取技術，其重要優勢是能夠區分真正的過敏反應和交叉反應，可有效提高過敏反應檢測的準確性及效率[14]。

3.2.5 體液檢測: 目前，蛋白質芯片體液檢測技術已被用于確定嫌疑人并建立刑事案件。蛋白質體液檢測芯片采用掠角沉積法制備長度為500 nm的銀納米棒-金屬增強熒光傳感器，并應用氨基功能化技術提高其結合能力，可以選擇性識別精液和陰道液，且不存在交叉反應，準確率比市面上的快速染色鑒別精液試劑盒高10倍[15]。

3.2.6 信號分子檢測: 蔡蘇娜等[16]研究白楊素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路發揮抗炎抗氧化作用的機制時，使用蛋白質芯片技術對發揮作用的信號分子進行篩選，并通過蛋白質印跡法進行驗證，發現AKT/mTOR信號通路可被脂多糖激活，但又可被白楊素抑制。由此闡明，白楊素通過抑制上游活性氧(ROS)信號分子的合成，最終抑制相關促炎因子誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環氧化酶-2(COX-2)的合成與釋放，這為白楊素的臨床應用以及其他抗炎藥物的篩選提供了技術方法與理論基礎。

3.3 組織芯片的應用

3.3.1 腫瘤研究: 為了更好地了解前列腺癌患者異質性結局的分子基礎, OUELLET V等[17]根據檢測目的和疾病狀態的差異構建了3個獨立的組織微陣列(TMA)集，即以淋巴結為主的檢測前列腺癌生物標志物及淋巴結轉移的TMA1、以雄激素剝奪治療前后組織為主的檢測前列腺癌對雄激素受體/雄激素軸抑制作用的反應的TMA2、用于評估致死性前列腺癌轉移中不同解剖部位分子標記物異質性的TMA3。該資源現可作為前列腺癌生物標志物驗證的工具，解決有關疾病進展和治療反應的重要臨床問題。

3.3.2 新藥開發: REN L等[18]通過簡單的光刻和激光切割構建高通量的心臟組織芯片，并結合微凹槽和電脈沖刺激，模擬心肌細胞電生理特性，再現了心肌細胞的良好排列結構和同步跳動，通過鑒定芯片上培養的心肌細胞的成熟情況和表型變化，可以評估各種藥物治療對心臟的毒性作用和保護效果。相較于動物模型和傳統的細胞培養，這項技術更接近人體生理條件，為臨床前藥物開發提供了高通量的藥物篩選平臺。

3.3.3 罕見病樣本收集與研究: LEE C J等[19]收集并使用軟組織肉瘤患者的腫瘤材料構建TMA, 2015—2021年該團隊已經構建了7個軟組織肉瘤亞型的疾病特異性TMA, 還構建了1個覆蓋了陣列中重要組織病理學亞型的多肉瘤TMA, 每個TMA塊上都包含重復的幾例某亞型的腫瘤組織，通過留存、使用并擴大這些包含腫瘤組織實體的芯片，可有效篩選腫瘤亞型，并為尋找藥物靶點提供工具。由于腫瘤家族的異質性, TMA的種類也在逐漸擴大，可見組織芯片技術為罕見病的研究提供了更有效且具有成本效益的方式，同時也促進了不同課題組間的學術研究合作。

3.4 細胞芯片的應用

作為對基因芯片、蛋白質芯片的一種補充，細胞芯片是以活細胞作為研究對象，主要用于活細胞的培養以及活細胞中基因、蛋白質等生物組分的檢測等。KIM G J等[20]應用計算機輔助設計并制作了一種工業聚乳酸材質的3D支架細胞芯片，該芯片可以促進細胞增殖和運動神經元分化。ABDULLA A等[21]建立了集成的微流控單細胞免疫印跡芯片，將對單個循環腫瘤細胞的分離、富集以及免疫印跡分析集成于同一系統，有助于提高豐度且減少其他細胞的干擾，基于此技術其成功地從順鉑處理的細胞中鑒定出一個傳統批量分析無法檢測到的細胞亞群——凋亡陰性(bax陰性)細胞亞群。LIU Y等[22]則基于微流控芯片開發了一種無凝膠的單細胞培養陣列用于培養結腸癌干細胞，大大提高了腫瘤球的成球率和腫瘤干細胞的培養效率, 1次培養大約獲得13 600個細胞，可更有效地用于芯片外的細胞檢測，這對于腫瘤生物學的研究和腫瘤干細胞特異性治療策略的發展都具有巨大意義。

3.5 糖芯片的應用

目前，糖芯片主要通過檢測糖分子與其他生物大分子的相互作用情況而分析不同種類糖分子的結構、功能與作用方式等。HOUEIX B等[23]通過糖芯片對人類共生副干酪乳桿菌的黏附素及其碳水化合物配體和包括人類在內的10種哺乳動物的胃腸道黏蛋白結合情況進行測定，為共生細菌在胃腸道的定植位點研究提供了依據。NANNO Y等[24]構建了一種包含超過400個糖綴合物的糖抗原芯片，檢測5只食蟹猴移植成年豬胰島后的免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗體特異性和相對濃度，為豬-猴胰島異種移植后誘導抗體的碳水化合物表位分析提供了重要證據，并提示了未來胰島異種移植中基因編輯的可能靶點。WAKAO M等[25]則利用表面等離子體共振生物傳感器在黏蛋白O-聚糖糖鏈配體糖芯片上對凝集素進行分析，揭示了黏蛋白O-聚糖的核心3結構與植物凝集素Jacalin存在特異性相互作用。

4 展 望

從單純地將生物組分集成以降低成本、提高效率，到實驗步驟的集成，再到對組織、器官自然狀態的模擬，生物芯片技術發展迅猛，且在醫學生物研究領域中展現出了巨大的應用前景。近年來，隨著微技術和芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)技術在生命科學領域中的發展，微流體與組織工程無縫融合，研究人員已開發出器官芯片(Organ-on-a-Chip)平臺，即在生物芯片上模擬器官的生理活動及功能，這對疾病機制研究、藥物研發和個體化用藥方案制訂均具有重大意義，同時也減少了實驗動物的使用量[26]。目前，臨床研究人員已經構建了幾乎所有器官的單器官芯片模型[27], 后續的開發方向之一是將傳感器集成到芯片中，從而實現更容易地檢測關鍵性生理參數[28-29], 該領域的進一步發展可帶來革命性的發現[26]。相關研究[30]指出，未來的器官芯片應該是多器官協同的和個體化的，例如可使用患者自身的細胞或活檢組織在生物芯片上模擬疾病在患者體內的復雜變化。受到技術設備、操作、費用等因素的限制，目前生物芯片尚難以走出實驗室，故開發操作簡單、價格低廉的生物芯片是生物芯片得以廣泛應用的前提，也是未來該領域重要的發展目標。