基質(zhì)相互作用分子1/鈣通道蛋白1在哮喘氣道高反應(yīng)性中的上皮表達(dá)和作用

桂 萍, 曾憲聰

(湖北省十堰市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 湖北 十堰, 442000)

哮喘是全球最常見的慢性病之一[1]。氣道高反應(yīng)性(AHR)是過敏性哮喘的主要特征[2]。AHR與氣道平滑肌(ASM)收縮有關(guān)，并受胞質(zhì)鈣離子(Ca2+)水平調(diào)節(jié)，突出了Ca2+穩(wěn)態(tài)在哮喘中的重要性[2]。全基因組分析確定了12個(gè)與哮喘相關(guān)的表觀遺傳相互作用基因，包括基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)[3]。STIM1是一種鈣調(diào)節(jié)激素，廣泛分布于腎臟、子宮內(nèi)膜和肺等組織中，可以通過激活鈣通道蛋白1(Oria1)介導(dǎo)鈣庫操縱的鈣內(nèi)流(SOCE)[4]。因此，本研究假設(shè)STIM1可能是與哮喘AHR相關(guān)的重要上皮衍生因子，其通過介導(dǎo)Ca2+流入來調(diào)節(jié)ASM收縮。驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究擬通過建立哮喘小鼠模型，探討STIM1/Orail信號通路介導(dǎo)的SOCE在AHR中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只雌性Balb/c小鼠[8～10 周齡, (20.0±1.1) g]購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件[溫度為(22±1) ℃; 濕度為55%～60%; 12 h明暗循環(huán))]下飼養(yǎng)，可自由獲取水和食物。適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組(每組12只)，即對照組(CON)、雞卵清蛋白(OVA)組和OVA+sh-STIM1組(OVA來源于雞蛋，是一種常用的過敏原，可在實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物中誘發(fā)過敏性肺部炎癥。)。參照文獻(xiàn)[5]中方法建立OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型。除對照組外，其他組分別在第0、7、14天通過腹腔注射50 μg OVA(純度≥98%, 美國Sigma-Aldrich公司)致敏。小鼠用異氟醚麻醉，連續(xù)3 d(第21、22、23天)通過吸入溶解在100 μL生理鹽水中的150 μg OVA進(jìn)行致敏。對照組采用等量生理鹽水處理。OVA+sh-STIM1組小鼠在第21、22、23天用OVA致敏前8 h, 通過鼻內(nèi)給予100 μL慢病毒介導(dǎo)的STIM1小干擾RNA[sh-STIM1, 漢恒生物科技(上海)有限公司]。

1.2 慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾載體的構(gòu)建與感染

對于短發(fā)夾RNA (shRNA) 介導(dǎo)的STIM1敲低，用從上海GeneChem Corporation公司購買的STIM1-pGCSIL-GFP質(zhì)粒產(chǎn)生的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。shRNA的靶向序列為[6]: 5′-GGAGGATAA TGGCTCTATT-3′。陰性對照是與任何已知人類基因沒有序列同源性的雙鏈shRNA。對于基因沉默，將純化的慢病毒(sh-STIM1-1)以20的感染復(fù)數(shù)添加到細(xì)胞中，持續(xù)8 h, 并用培養(yǎng)基洗滌2次。通過GFP表達(dá)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)感染復(fù)數(shù)為20時(shí), 72 h后癌細(xì)胞感染率超過90%。因此，本研究在所有實(shí)驗(yàn)中對慢病毒使用了20的感染復(fù)數(shù)，因?yàn)槠湓谒璧臅r(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了最佳的基因敲低。對照細(xì)胞用陰性對照shRNA感染。

1.3 氣道高反應(yīng)性的測量

在實(shí)驗(yàn)第24天，通過全身氣壓體積描記在8～10周齡的小鼠(每組6只小鼠)中評估對乙酰甲膽堿(Mch, 美國Sigma-Aldrich公司)的氣道反應(yīng)性。小鼠用戊巴比妥(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，并暴露于含Mch(0、3.125、6.250、12.500、25.000和50.000 mg/mL)的磷酸鹽緩沖液(PBS)霧化中，利用全身瀑體積測量法(型號 PLY 3211, 美國Buxco Electronic公司)記錄增強(qiáng)的停頓(Penh)。

1.4 蘇木精和曙紅染色及炎癥評分

在實(shí)驗(yàn)第24天，處死小鼠，取右上葉石蠟包埋，矢狀切片(5 μm厚)，蘇木精-伊紅(HE)染色。將炎癥浸潤程度定為: 0分，無炎癥細(xì)胞; 1分，炎癥細(xì)胞少; 2分，炎癥細(xì)胞呈圓形，厚度為1個(gè)細(xì)胞; 3分，炎癥細(xì)胞呈圓形，厚度為2～4個(gè)細(xì)胞; 4分，炎癥細(xì)胞形成圓形，厚度>4個(gè)細(xì)胞。由對樣本不知情的研究人員在每張載玻片上隨機(jī)選擇的6個(gè)區(qū)域中對炎癥進(jìn)行評分。總炎癥評分計(jì)算為所有個(gè)體炎癥評分的平均值。

1.5 免疫熒光染色

肺組織切片(5 μm) 進(jìn)行抗原修復(fù)，并在室溫下浸入山羊血清15 min, 以避免非特異性結(jié)合。然后將切片與1∶50稀釋的抗STIM1 (美國Santa cruz公司) 一抗在4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌3次后，將切片與1∶200稀釋的Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(上海Beyotime公司)在室溫下一起孵育90 min。最后，切片用二脒基苯基吲哚(DAPI)染色并用PBS洗滌3次。在放大倍數(shù)為400倍的熒光顯微鏡下觀察切片。

1.6 免疫組織化學(xué)

通過免疫組織化學(xué)染色檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在肺組織中的表達(dá)。用于免疫染色的主要抗體如下: 兔抗α-SMA多克隆抗體(1∶100, 英國Abcam公司)。二級抗體為HRP標(biāo)記的抗兔抗體(美國Jackson ImmunoResearch公司)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

所有組均進(jìn)行氣管分離，行氣管插管，用0.5 mL PBS灌洗小鼠支氣管肺泡，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF), 共3次，每次回收率達(dá)82%。根據(jù)ELISA試劑盒說明(美國R&D公司)，檢測小鼠BALF中白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)和IL-13水平。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)

人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMC，美國Sciencell公司)接種在SMCM培養(yǎng)基(Sciencell)中，并在37 ℃、5%CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。HASMC連續(xù)傳代并取第4代用于實(shí)驗(yàn)。將HASMC以1×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組: 對照組(CON)、ACh組、ACh+sh-STIM1組和sh-STIM1組。ACh+sh-STIM1組和sh-STIM1組細(xì)胞在乙酰膽堿(ACh)干預(yù)前用sh-STIM1-1感染細(xì)胞8 h，以敲低細(xì)胞中STIM1表達(dá)。

1.9 細(xì)胞收縮試驗(yàn)

將HASMC重新懸浮在使用冷膠原蛋白Ⅰ型(純度=90%, 溶于0.02 mol/L乙酸的液體, 1.5 mg/mL, 美國BD Biosciences公司)制備的膠原蛋白溶液中，該膠原蛋白溶液每孔含有1.5×105個(gè)細(xì)胞。將凝膠加入24孔板 (600 μL/孔) 并在 37 ℃下聚合90 min。將ACh(美國Sigma-Aldrich公司)添加到適當(dāng)?shù)目字兄两K濃度為100 μmol/L, 并在4 h時(shí)拍攝照片。處理后立即使用滅菌探針從孔邊緣提起凝膠。使用NIH Image J 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量每個(gè)凝膠的表面積。

1.10 鈣成像

通過Fura-2AM(鈣離子熒光探針，上海Beyotime公司)測量HASMC中的鈣成像。將24孔板(2.5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中的HASMC與250 μL含有2.5 μL/mL Fura-2AM的標(biāo)準(zhǔn)林格氏溶液(pH值為7.4)孵育30 min。然后用HBSS洗滌細(xì)胞3次。將HBSS中的ACh(100 μmol/L)或thapsigargin抑制劑(TG, 2 μmol/L)添加到相關(guān)孔中，并在37 ℃下孵育2 h。去除上清液以拍攝圖像。使用珀耳帖冷卻電荷耦合器件(CCD)相機(jī)(美國Roper Scientific公司)在熒光顯微鏡(10倍物鏡)下檢測細(xì)胞中的Fura-2AM熒光。使用熒光濾光片組在495 nm和518 nm處交替獲得Fura-2AM熒光。信號轉(zhuǎn)換為相對變化(F/F0), 其中F0是時(shí)間0的平均熒光強(qiáng)度(495/518)的比率。每孔記錄15個(gè)細(xì)胞。

1.11 蛋白質(zhì)印跡

使用SDS裂解緩沖液收獲細(xì)胞。不同處理組中等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)。膜在3%牛血清白蛋白(BSA)中封閉，隨后與兔多克隆Oria1抗體(1∶1 000, 美國Cell Signaling Technology公司)、兔單克隆抗體GAPDH(1∶1 000, 美國Cell Signaling Technology公司)在4 ℃下孵育過夜。HRP偶聯(lián)的單克隆山羊抗兔IgG(1∶5 000, 上海Bioworld公司)抗體用作二抗。使用ECL試劑(美國Millipore公司)顯示條帶。使用NIH Image Pro對光密度掃描進(jìn)行量化，并將值表示為與GAPDH相比的相對強(qiáng)度。

1.12 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)分離總RNA。然后使用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(日本Takara公司)將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA, 并使用TaqMan Gene Expression Assay試劑盒在ABI Prism 7000(美國Applied Biosystems公司)上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR分析。PCR中使用的引物如下,STIM1: 5′-AGTCACAGTGAGAAGGCGAC-3′(正向), 5′-CAATTCGGCAAAACTCTGCTG-3′(反向);Orai1: 5′-GACTGGATCGGCCAGAGTTAC-3′(正向), 5′-GTCCGGCTGGAGGCTTTAAG-3′(反向);GAPDH: 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′(正向), 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′(反向)。循環(huán)條件是在95 ℃下初始變性30 s, 然后在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s和72 ℃ 10 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用2-△△CT方法計(jì)算數(shù)據(jù)并歸一化為GAPDH。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 STIM1在鼠支氣管上皮細(xì)胞中高表達(dá)

OVA組小鼠表現(xiàn)出氣道阻力增加(圖1A)以及組織(圖1B)和BALF(圖1C、D)炎癥。免疫熒光染色分析表明，與對照組相比，在OVA處理動(dòng)物的支氣管上皮細(xì)胞中STIM1表達(dá)增加(圖1E、F), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明STIM1在哮喘過敏模型中表達(dá)增加。

A: 氣道阻力的評估,各組通過flexiVent測量對乙酰甲膽堿(0～50 mg/mL)劑量增加的氣道阻力,以記錄增強(qiáng)暫停(n=6); B: 氣道炎癥的評估,蘇木精-伊紅染色觀察支氣管周圍和肺泡區(qū)域的炎性細(xì)胞浸潤; C: 各組之間的BALF中總白細(xì)胞計(jì)數(shù); D: OVA組和OVA+sh-STIM1組BALF中白細(xì)胞的數(shù)量(NEU: 中性粒細(xì)胞; LYM: 淋巴細(xì)胞; MON: 單核細(xì)胞; EOS: 嗜酸性粒細(xì)胞); E、F: 各組支氣管上皮細(xì)胞中STIM1表達(dá)的免疫熒光染色分析。與對照組相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; 與OVA組相比, #P<0.05, ###P<0.001。圖1 STIM1在鼠支氣管上皮細(xì)胞中高表達(dá)

2.2 STIM1敲低消除過敏性哮喘小鼠OVA誘導(dǎo)的AHR和ASM收縮

為了確定STIM1水平的降低是否與過敏性哮喘的病理學(xué)相關(guān)，本研究探討了STIM1敲低對AHR的影響(圖1E、F)。與對照組相比, OVA組Mch激發(fā)后氣道阻力增加，這被鼻內(nèi)sh-STIM1逆轉(zhuǎn)(圖1A、B)。免疫組織化學(xué)分析表明, OVA增強(qiáng)α-SMA表達(dá)(ASM激活的標(biāo)志物)被鼻內(nèi)sh-STIM1顯著抑制(圖2)。這些結(jié)果表明STIM1在哮喘AHR中具有作用。

2.3 STIM1敲低抑制炎癥細(xì)胞浸潤及相關(guān)因子釋放

OVA顯著增強(qiáng)肺泡和支氣管周圍的炎性細(xì)胞浸潤，鼻內(nèi)sh-STIM1治療顯著減弱(圖1B)。BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)表明, sh-STIM1給藥顯著抑制BALF中的細(xì)胞總數(shù)以及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量(圖1C、D)。OVA增強(qiáng)BALF表達(dá)Th2細(xì)胞因子釋放，并且sh-STIM1治療減弱OVA誘導(dǎo)的IL-13、IL-5和MCP-1釋放，但對OVA誘導(dǎo)的IL-4釋放無影響。見表1。

2.4 STIM1敲低對ASM細(xì)胞的收縮力和Ca2+流入影響

為了進(jìn)一步探討STIM1對ASM的影響，本研究在體外使用了HASMC。ACh(100 μmol/L)誘導(dǎo)膠原基質(zhì)中的HASMC在4 h后收縮約80%, 而對照組收縮約40%。sh-STIM1對HASMC的收縮沒有影響[(41.31±3.27)%與(44.49±0.36)%]。然而，與sh-STIM1預(yù)處理顯著抑制ACh誘導(dǎo)的收縮，表明ACh通過降低ASM收縮性來調(diào)節(jié)AHR(圖3A)。ASM收縮性由Oria1調(diào)節(jié), ACh增加Oria1表達(dá)，通過sh-STIM1預(yù)處理完全減弱(圖3B)。ACh以濃度依賴性的方式增加了HASMC的SOCE, 這被sh-STIM1預(yù)處理完全消除(圖3C)。用非競爭性Ca2+ATP酶TG抑制劑(2.0 μmol/L)和1.2 mmol/L Ca2+處理HASMC可激活SOCE, 并進(jìn)一步升高細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平，而sh-STIM1可降低這種效應(yīng)(圖3D)。PCR結(jié)果顯示, TG增強(qiáng)了STIM1mRNA和Orai1mRNA在HASMC中的表達(dá)，而sh-STIM1抑制了STIM1和Orai1表達(dá)(圖3E)。

與對照組相比, **P<0.01; 與OVA組相比, #P<0.05。圖2 通過免疫組織化學(xué)定量支氣管周圍α-SMA蛋白表達(dá)和定量分析(n=6)

表1 STIM1敲低對BALF中炎癥因子釋放影響 pg/mL

A: 用sh-STIM1和ACh處理ASM細(xì)胞的凝膠收縮代表性圖像; B: Oria1蛋白表達(dá)的代表性免疫印跡圖像和定量分析; C: sh-STIM1抑制ACh誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+增加(F/F0代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均峰值熒光強(qiáng)度變化); D: sh-STIM1抑制TG誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+增加; E: 通過RT-qPCR測定sh-STIM1對ASM細(xì)胞中STIM1和Orai1 mRNA表達(dá)的影響。與對照組相比, ***P<0.001; 與ACh或TG組相比, #P<0.05, ###P<0.001。圖3 STIM1敲低對ASM細(xì)胞的收縮力和Ca2+流入影響

3 討 論

哮喘是一種復(fù)雜的疾病; AHR是哮喘表現(xiàn)的核心，與ASM收縮變化密切相關(guān)[7]。Ca2+信號對ASM細(xì)胞收縮、生長和遷移至關(guān)重要。SOCE通道是Ca2+進(jìn)入ASM細(xì)胞的普遍方式之一[8]。STIM1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+傳感器，其在限定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/質(zhì)膜連接區(qū)域寡聚化，以激活Orai1形成SOCE通道[9]。STIM1/Orai1偶聯(lián)的機(jī)制包括將STIM1的約100個(gè)氨基酸的C端卷曲螺旋區(qū)與Orai1四聚體的C端和N端直接結(jié)合[10]。哮喘中的ASM收縮變化與Ca2+處理異常以及離子通道及泵的表達(dá)變化有關(guān)[11]。本研究數(shù)據(jù)表明，氣道上皮源性STIM1增加可能與ASM收縮和AHR有關(guān)，表明STIM1可能是一種潛在的內(nèi)皮源性收縮因子。

上皮細(xì)胞是抵抗氣道中有毒和過敏物質(zhì)的第一道防線。除了物理屏障功能外，氣道上皮還通過釋放環(huán)氧合酶產(chǎn)物和內(nèi)皮源性收縮因子在ASM張力的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。本研究表明，STIM1主要定位于支氣管上皮，對過敏性哮喘小鼠模型鼻內(nèi)給予sh-STIM1可降低AHR。IL-13是一種Th2型細(xì)胞因子，與過敏性哮喘的發(fā)病有關(guān)[12]。IL-13除了對杯狀細(xì)胞增生和增加黏液產(chǎn)生作用外，還可直接調(diào)節(jié)ASM的高收縮性，從而誘導(dǎo)哮喘患者的AHR[13]。此外, IL-13增加了HASMC對各種收縮劑(如組胺)的Ca2+反應(yīng)[14]。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了IL-13在過敏性哮喘AHR中的作用。本研究中, STIM1敲低可降低哮喘小鼠的AHR和炎癥反應(yīng)，表明STIM1對哮喘具有惡化作用, STIM1的過度活躍可能是對IL-13誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)激反應(yīng)的一種代償機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)與既往研究[15-16]一致，表明STIM1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，參與誘導(dǎo)組織損傷，如急性肺損傷和心肌梗死。

ASM的超收縮性與哮喘的AHR密切相關(guān)[7]。一般ASM收縮是在氣道炎癥的背景下研究。然而，在使用膠原凝膠收縮試驗(yàn)對單個(gè)ASM細(xì)胞進(jìn)行的研究中, ASM收縮不僅與氣道炎癥有關(guān)，還可能是由哮喘固有異常引起的，該異常在沒有哮喘氣道環(huán)境的原代培養(yǎng)中持續(xù)存在，表明哮喘ASM發(fā)生表觀遺傳或信號通路重塑[17]。ASM收縮是由增加的胞漿Ca2+水平引起的，隨后開始形成Ca2+-鈣調(diào)蛋白-肌球蛋白輕鏈激酶復(fù)合物，激活Oria1介導(dǎo)的SOCE。在此基礎(chǔ)上，本研究探討了STIM1對ASM收縮的作用。本研究結(jié)果顯示，鼻內(nèi)滴注sh-STIM1逆轉(zhuǎn)了OVA誘導(dǎo)的過敏小鼠AHR。sh-STIM1通過抑制鈣依賴性O(shè)ria1表達(dá)，進(jìn)而抑制HASMC收縮性。由于SOCE對調(diào)節(jié)HASMC的Ca2+穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，Oria1與STIM1的相互作用對SOCE具有正性調(diào)節(jié)作用[18]。因此, STIM1通過直接調(diào)節(jié)ASM內(nèi)在收縮和間接控制過敏性哮喘炎癥的關(guān)鍵特征來促進(jìn)AHR, 從而使STIM1成為內(nèi)皮源性收縮因子。

綜上所述，本研究證明上皮細(xì)胞中STIM1調(diào)節(jié)ASM收縮和AHR, 其作用機(jī)制與激活Oria1介導(dǎo)的SOCE有關(guān)。這些數(shù)據(jù)為整合哮喘上皮細(xì)胞和ASM細(xì)胞相互作用以及增強(qiáng)AHR的機(jī)制提供了新見解，進(jìn)而促進(jìn)了對哮喘發(fā)病機(jī)制的深入理解。