ω-3多不飽和脂肪酸對熱應激小鼠肝臟損傷的保護作用研究

王亞娜 楊慧娣 李光鵬

熱應激(heat stress，HS)對人類和動物可產(chǎn)生負面影響，對公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。近年來，全球氣溫持續(xù)上升，據(jù)統(tǒng)計，歐洲因中暑死亡的案例平均每年超過2.5萬例[2]。此外，熱應激的不利影響將隨著全球變暖而逐漸惡化[3]。有報道稱，熱應激在人類、肉仔雞、豬和嚙齒類動物中可引起局部和全身性炎癥[4～7]。也有研究表明，熱應激在大腦、腎臟、脾臟、肝臟和肺等器官中可以引起炎性反應，特別是作為哺乳動物主要代謝和解毒器官的肝臟，在熱應激誘導下可以產(chǎn)生炎癥[8～12]。在一項大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，熱應激導致大鼠產(chǎn)生過量促炎性細胞因子，引發(fā)肝功能紊亂[13]。因此，抑制炎癥對熱應激的預防和(或)治療具有重要意義。

ω-3多不飽和脂肪酸主要包括α-亞麻酸(alpha-linolenic acid, ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)[14]。既往研究表明，ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acid, ω-3 PUFA)對健康具有潛在的益處，被認為是哺乳動物的必需營養(yǎng)物質(zhì)[15]。由于人類等哺乳動物體內(nèi)缺乏ω-3脂肪酸脫氫酶，不能將ω-6 PUFA轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFA，因此，ω-3 PUFA必須從飲食中獲取。ω-3 PUFA具有強大的抗炎特性，已被證明可以預防和(或)治療部分由炎性細胞因子誘導的肝病，包括非酒精性脂肪肝、藥物誘導的肝毒性、酒精性肝病和高脂飲食誘導的肝損傷[16～19]。ω-3 PUFA極不穩(wěn)定，比其他類型的脂肪酸更容易被氧化，目前ω-3 PUFA對肝臟炎癥的影響仍存在爭議。本研究采用FAD3轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物模型，進一步探討ω-3 PUFA對熱應激小鼠肝臟炎癥的作用[20]。

本研究采用的FAD3轉(zhuǎn)基因小鼠為攜帶胡麻FAD3基因的小鼠。FAD3基因可編碼ω-3脂肪酸脫氫酶，此酶能將ω-6 PUFA轉(zhuǎn)化成ω-3 PUFA，從而使FAD3轉(zhuǎn)基因小鼠自身合成ω-3 PUFA，特別是EPA和DHA的含量顯著增多。此外，與C57BL/6野生型小鼠比較，F(xiàn)AD3轉(zhuǎn)基因小鼠的ω-6 PUFA/ω-3 PUFA比值在肝臟、心臟和小腸等組織中明顯降低。因此，F(xiàn)AD3轉(zhuǎn)基因小鼠為研究ω-3 PUFA的生物功能、各種生理過程以及疾病中ω-6 PUFA/ω-3 PUFA比值的重要性提供了一個非常好的動物模型[20]。

對象與方法

1.研究對象：5周齡SPF級成年健康雄性C57BL/6野生型小鼠16只{購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]}，F(xiàn)AD3轉(zhuǎn)基因小鼠16只(內(nèi)蒙古大學實驗動物中心贈送)，初始體質(zhì)量18～20g，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古大學實驗動物中心[實驗動物許可證號：SYXK(蒙)2014-0002]。動物房內(nèi)環(huán)境溫度為23±1℃，光照時間為8:00～20:00時，環(huán)境相對濕度為50%～60%，給予國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由取食飲水。實驗開始前單籠(30cm×15cm×20cm)飼養(yǎng)，適應1周后分別在室溫(23±1℃)和高溫(30℃)環(huán)境下飼養(yǎng)。高溫環(huán)境(30℃)由江蘇金怡儀器科技有限公司的DB-IV數(shù)顯恒溫電熱板24h循環(huán)提供。所有操作在內(nèi)蒙古大學省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室內(nèi)完成，遵循內(nèi)蒙古大學動物使用相關倫理要求(批號：YKD2019142)。實驗分為C57BL/6C組(n=8)：室溫(23±1℃)下野生型C57BL/6C小鼠；C57BL/6H組(n=8)：高溫(30℃)下野生型C57BL/6C小鼠；FAD3C組(n=8)：室溫(23±1℃)下FAD3轉(zhuǎn)基因小鼠；FAD3H組(n=8)：高溫(30℃)下FAD3轉(zhuǎn)基因小鼠。第7周末，夜間禁食12h后，次日上午(8:00～9:00時)從小鼠眼底采集血樣后，用過量CO2處死動物，獲取小鼠肝臟組織進行實驗研究。迅速剪取肝臟組織，依次用0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙擦拭后稱重，隨后將部分肝臟組織立即置于液氮中冷凍，-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.研究方法：(1)實驗開始前給予小鼠足夠量的飼料塊，稱取并記錄初始體質(zhì)量和加飼料量。上午9：00～10：00時用電子天平稱取并記錄體質(zhì)量和剩余飼料量(精確到0.01g)，每4天測量1次。計算每組小鼠的平均體質(zhì)量增量和平均日攝食量。食物攝入量采用食物平衡法測定，即平均日攝食量=(供給飼料-剩余飼料)/4。(2)上午9:00～10:00時，測量小鼠直腸溫度，每4天測量1次。具體方法如下：在肛溫計探頭上涂抹少許凡士林，輕柔緩慢插入小鼠直腸約3cm左右并固定，待示數(shù)穩(wěn)定時(約30s)，測取直腸溫度并記錄(精確到0.1℃)。測定之前反復抓取幾次小鼠，使其熟悉測定過程，避免產(chǎn)生抓持應激。(3)各組小鼠眼底采集血樣后，離心(4℃，2500×g，15min)，收集血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4)采用AST試劑盒(貨號：QC10487，中國上海欽誠生物公司)和ALT試劑盒(貨號：HS4638，中國上海滬崢生物公司)檢測AST和ALT的含量。(5)采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測肝臟組織炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)以及熱休克蛋白72(heat shock proteins 72，HSP72)mRNA表達水平。具體操作過程：使用RNA提取液(貨號：G3013，武漢賽維爾生物科技有限公司)提取肝臟組織總RNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度和純度，然后用試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴增引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設計提供，詳見表1。使用熒光定量PCR儀(ABI7500，美國ABI公司)進行實時PCR擴增。PCR反應體系由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。具體過程為：在PCR管中加入以下試劑：2.0μl cDNA，1.5μl的2.5μmol/L基因引物(上游引物和下游引物)，7.5μl的2×SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)和4.0μl的無RNA酶的雙蒸水(ddH2O)。反應程序為：95℃欲變性10min，95℃變性15s，然后60℃退火/延伸30s，共40個循環(huán)。反應完成后采用2-ΔΔCt法計算本研究熒光定量PCR所有靶基因的相對表達量。由以下公式得ΔΔCt值： ΔΔCt=(Ct靶基因-CtGAPDH)處理組-(Ct靶基因-CtGAPDH)對照組。靶基因的相對表達水平的變化公式：靶基因相對表達倍數(shù)=2-ΔΔCt。

表1 目的基因引物序列

結(jié) 果

1.各組平均體質(zhì)量增量、平均日攝食量、肝重以及肝重比的比較：經(jīng)過高溫處理后，C57BL/6H組小鼠平均體質(zhì)量增量和平均日攝食量比C57BL/6C組明顯降低(P<0.05)，肝重和肝重比比C57BL/6C組明顯增加(P<0.05)。平均體質(zhì)量增量、平均日攝食量、肝重和肝重比在FAD3H組與FAD3C組、FAD3C組與C57BL/6C組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，溫度與ω-3 PUFA之間對平均體質(zhì)量增量、平均日攝食量以及肝重比有交互作用(P<0.05)，對肝重沒有交互作用(P>0.05)，詳見表2。

表2 各組小鼠生長性能參數(shù)比較

2.各組直腸溫度比較：經(jīng)過高溫處理后，C57BL/6H組的直腸溫度比C57BL/6C組明顯升高(P<0.05)，而FAD3H組與FAD3C組、FAD3C組與C57BL/6C組的直腸溫度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1A)。

3.各組HSP72mRNA表達水平比較：經(jīng)過高溫處理后，C57BL/6H組HSP72mRNA表達水平比C57BL/6C組明顯增加(P<0.05)。而FAD3H組的HSP72mRNA表達水平明顯低于C57BL/6H組(P<0.05，圖1B)。

圖1 各組直腸溫度和HSP72mRNA表達水平A.直腸溫度；B.HSP72mRNA表達水平。與C57BL/6C組比較，*P<0.05；與C57BL/6H組比較，#P<0.05

4.各組血清AST和ALT含量比較：經(jīng)過高溫處理后，C57BL/6H組的血清AST和ALT含量比C57BL/6C組明顯升高(P<0.05)。而FAD3H組的血清AST和ALT含量顯著低于C57BL/6H組(P<0.05，圖2)。

圖2 各組血清AST和ALT含量A.AST；B.ALT。與C57BL/6C組比較，*P<0.05；與C57BL/6H組比較，#P<0.05

5.各組炎癥相關指標在肝臟中的基因表達水平比較：經(jīng)過高溫處理后，C57BL/6H組肝臟MCP-1、TNF-α、IL-1β以及IL-6mRNA表達水平明顯高于C57BL/6C組(P<0.05)。而FAD3H組肝臟MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達水平明顯低于C57BL/6H組(P<0.05)，且與FAD3C組和C57BL/6C組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，IL-10mRNA表達水平在4組之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 各組肝臟中促炎性細胞因子表達水平與C57BL/6C組比較，*P<0.05；與C57BL/6H組比較，#P<0.05

討 論

ω-3 PUFA已被證明對肝臟的損傷具有保護作用[16～19]。普遍認為，AST和ALT通常在肝細胞中表達。然而，在肝臟受損的情況下，ALT和AST釋放到血液循環(huán)中會導致血清中ALT和AST的活性增加。因此，血清中AST和ALT活性的升高被認為是肝損傷的特異性標志[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，熱應激可增加肉仔雞血清AST和ALT的活性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過高溫飼養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因(內(nèi)源性補充ω-3 PUFA)的方法，可降低高溫誘導小鼠血清AST和ALT含量的增加，改善熱應激引起的肝損傷。由于小鼠缺少汗腺，高溫環(huán)境中的小鼠不能及時散發(fā)出多余的熱量，熱應激可以使機體直腸溫度、平均體質(zhì)量增量、平均日攝食量、肝重和肝重比均受到負面影響。本研究結(jié)果顯示，熱暴露使小鼠平均體質(zhì)量增量和平均日攝食量明顯降低，直腸溫度和HSP72mRNA表達水平明顯增加，表明高溫誘導小鼠產(chǎn)生了熱應激。同時熱應激小鼠血清AST、ALT、肝重以及肝重比升高，暗示熱應激小鼠發(fā)生了肝損傷。然而，補充ω-3 PUFA可改善熱應激誘導的平均體質(zhì)量增量、平均攝食量、直腸溫度、肝重和肝重比的負面影響。

在高溫環(huán)境下，機體會產(chǎn)生多種細胞因子(如TNF-α)，可導致肝臟等多個器官的出血和壞死。有研究認為，炎性細胞因子的產(chǎn)生與HSP72的過度表達有關[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應激小鼠肝臟中HSP72、促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及趨化因子MCP-1 mRNA表達水平均異常升高，而抗炎性細胞因子IL-10 mRNA表達水平?jīng)]有變化，表明熱應激誘導了小鼠肝臟中促炎性細胞因子的過表達，破壞了炎性細胞因子的動態(tài)平衡，進而使肝臟產(chǎn)生炎癥。大多數(shù)研究表明，ω-3 PUFA可抑制肝臟產(chǎn)生的促炎性細胞因子TNF-α、IL-6以及趨化因子MCP-1的釋放，也可抑制肝臟中巨噬細胞的浸潤[24, 25]。本研究結(jié)果顯示，ω-3 PUFA抑制了熱應激小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6以及MCP-1mRNA表達水平，這說明ω-3 PUFA可以降低促炎性細胞因子的過表達，進而改善肝臟炎癥。MCP-1又稱趨化因子配體2，是CC類趨化因子中的一個重要成員，是典型的炎性趨化因子，主要通過協(xié)調(diào)單核細胞在炎癥組織中的募集而發(fā)揮重要作用[26]。在本研究中，熱應激使MCP-1mRNA水平顯著上調(diào)，暗示熱應激在肝臟炎癥中的作用可能是由于MCP-1mRNA水平直接上調(diào)所致。既往研究發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFA通過抑制MCP-1基因表達水平來緩解2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)患者的炎性反應[27]。既往研究還表明，抑制肝臟中異常升高的MCP-1含量可以緩解小鼠的肝臟炎癥程度[28]。本研究結(jié)果顯示，ω-3 PUFA抑制了熱應激小鼠肝組織中MCP-1mRNA的表達水平。因此，ω-3 PUFA減輕熱應激小鼠肝臟炎癥可能是通過靶向抑制MCP-1的表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，ω-3 PUFA可以通過抑制趨化因子MCP-1和促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及HSP72mRNA的表達水平，降低血清AST和ALT的含量，進而改善熱應激誘導的肝損傷。這些結(jié)果表明，ω-3 PUFA可能是預防和(或)治療熱應激相關肝病的潛在治療劑，為熱應激所致肝臟損傷的治療提供理論依據(jù)。此外，有必要增加組織學和免疫組化檢測，觀察肝臟的組織學改變與炎癥情況，進一步探究ω-3 PUFA對肝臟保護作用機制。也可以設計良好體外細胞學和動物學實驗進一步探討ω-3 PUFA的3種類型(ALA、EPA和DHA)對肝臟作用的差異，以明確對肝臟發(fā)揮主要作用的ω-3 PUFA的脂肪酸類型。