基于NLRP3/IL-1β、IL-18通路探討CARDS Tx在兒童重癥肺炎支原體肺炎中的作用

曹囡囡 黃 莉 焦瓊杰 丁 霞 燕江雪 倪 倩

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是兒童社區(qū)獲得性肺炎的最常見病原體之一，具有時段性爆發(fā)流行的特點。肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)患兒多數預后良好，但重癥肺炎支原體肺炎(severe mycoplasma pneumoniae pneumonia，SMPP)患兒癥狀重、病程遷延，更易累及肺外多系統(tǒng)，如皮膚、神經系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等，若未及時干預，病情嚴重者可能合并多臟器衰竭而危及生命，預后易遺留肺部結構或功能后遺癥，影響患兒生活質量[1,2]。

社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(community-acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS Tx)是由MP產生的一種外毒素，與MP的致病力有關[3]。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)屬細胞內模式識別受體，激活后介導經典途徑的細胞焦亡發(fā)生，誘導極具促炎活性的白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-18大量產生，協同細胞焦亡后溢出的胞內容物引發(fā)強烈的炎癥級聯反應。CARDS Tx可能通過活化NLRP3參與SMPP的發(fā)生及進展[4]。

本研究通過觀察CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18在SMPP和MPP患兒的血清及SMPP患兒的患側及對側支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的變化，探討CARDS Tx和NLRP3/IL-1β、IL-18通路在兒童SMPP發(fā)生及進展過程中的致病作用，并評價CARDS Tx、NLRP3、IL-1β和IL-18對SMPP的預測價值。

對象與方法

1.研究對象：選取2020年10月～2021年9月蘭州大學第二醫(yī)院收治的MPP患兒為研究對象，根據疾病的嚴重程度將其分為MPP組和SMPP組。納入標準：①0～14歲兒童；②符合MPP或SMPP診斷標準(參照《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》[5])；③病程在14天以內；④獲得患兒家屬知情同意。排除標準：①合并病毒、細菌等其他病原體感染；②合并支氣管哮喘、慢性肺疾病、嚴重基礎疾病等；③1個月內使用過糖皮質激素、免疫調節(jié)劑、免疫抑制劑等藥物。本研究通過蘭州大學第二醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批(倫理審批號：2020A-208)。MPP組中采集到靜脈血標本共44例，未采集BALF標本。SMPP組中采集到靜脈血標本共35例；采集到BALF標本共26例，此26例患兒在符合SMPP診斷標準的同時，影像學檢查表現為單側肺受累，收集其患側(具有上述影像學表現側)和對側BALF標本，分別命名為患側組和對側組。選擇同期至蘭州大學第二醫(yī)院體檢、0～14歲并且近1個月內無感染史的26例健康兒童為對照組，采集其靜脈血標本。采集到靜脈血標本兒童的MPP組、SMPP組與對照組間年齡、性別資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 一般資料比較

2.標本采集：清晨空腹時(或至少禁食8h)、入院后但未予治療前，用紅色非抗凝管采集靜脈血3ml，于4℃環(huán)境下以3000r/min的速度離心15min后，留取上清，置于-80℃冰箱保存，以備檢測。入院后，在行電子支氣管鏡檢查并支氣管肺泡灌洗術的同時，分別采集患兒的患側與對側BALF，患側選擇病變段，對側選擇右肺中葉或左上葉舌段，總回收率≥30%、紅細胞<20%，且無大氣道分泌物混入為合格標本。將新鮮BALF收集至無菌塑料離心管中，反復凍融，于4℃環(huán)境下以3000r/min的速度離心15min后，留取上清，置于-80℃冰箱保存，以備檢測。

3.實驗方法：使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清和BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β和IL-18的水平。ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。酶標儀為Mulltiskan FC型酶標儀，購自賽默飛世爾儀器有限公司。

結 果

1.CARDS Tx與NLRP3的相關性分析：將血清中CARDS Tx與NLRP3水平進行Pearson相關性分析，CARDS Tx與NLRP3之間呈顯著正相關(r=0.757，P<0.001，圖1A)；將BALF中CARDS Tx與NLRP3水平進行Pearson相關性分析，CARDS Tx與NLRP3之間亦呈顯著正相關(r=0.465，P<0.01，圖1B)。

圖1 血清、BALF中CARDS Tx與NLRP3的相關性A.血清中CARDS Tx水平與NLRP3水平的相關性；B.BALF中CARDS Tx水平與NLRP3水平的相關性

2.BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比較：SMPP組患兒中，患側BALF中的CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平顯著高于對側，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表2)。

表2 患側與對側BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比較

3.血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比較：MPP組、SMPP組、對照組患兒血清中CARDS Tx水平相互比較，SMPP組(35.97pg/ml)>MPP組(29.38pg/ml)>對照組(18.11pg/ml)，差異有統(tǒng)計學意義(H=58.996，P<0.001)，詳見圖2A；血清中NLRP3水平相互比較，SMPP組(700.25±119.98pg/ml)>MPP組(543.18±109.55pg/ml)>對照組(462.20±64.86pg/ml)，差異有統(tǒng)計學意義(F=42.446，P<0.001)，詳見圖2B；血清中IL-1β水平相互比較，SMPP組(62.61pg/ml)>MPP組(47.58pg/ml)>對照組(35.57pg/ml)，差異有統(tǒng)計學意義(H=65.592，P<0.001)，詳見圖2C；血清中IL-18水平相互比較，SMPP組(264.18pg/ml)>MPP組(207.67pg/ml)>對照組(169.14pg/ml)，差異有統(tǒng)計學意義(H=58.601，P<0.001)，詳見圖2D。

圖2 MPP組、SMPP組、對照組血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比較A.MPP組、SMPP組、對照組血清中CARDS Tx水平比較；B.MPP組、SMPP組、對照組血清中NLRP3水平比較；C.MPP組、SMPP組、對照組血清中IL-1β水平比較；D.MPP組、SMPP組、對照組血清中IL-18水平比較

4.血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平對SMPP的預測價值：將非SMPP組兒童與SMPP組患兒血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18的水平進行ROC分析，各指標的曲線下面積(area under the curve，AUC)均大于0.7，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表3，圖3)。

圖3 血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平預測SMPP的ROC曲線

表3 血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平預測SMPP的ROC分析

討 論

CARDS Tx是由MP產生的一種外毒素，具有致細胞空泡化作用和腺苷二磷酸核糖基轉移酶(ADPribosyltransferase，ART)活性[6]。CARDS Tx內化進入靶細胞后發(fā)揮致病作用，其致細胞空泡化作用能夠直接損傷呼吸道屏障，ART活性是一種可逆的蛋白翻譯后的共價修飾作用，可以使分子構象發(fā)生改變，從而改變靶向分子的生物活性[7]。NLRP3受到病原相關分子模式或危險相關分子模式的刺激后首先上調NLRP3與IL-1β前體、IL-18前體的表達，物質準備完成后即募集凋亡相關斑點樣蛋白與半胱天冬氨酸蛋白酶-1前體啟動NLRP3炎性小體的組裝，介導下游細胞焦亡發(fā)生[8]。CARDS Tx可能通過對NLRP3蛋白的翻譯后修飾作用激活NLRP3，活化的NLRP3觸發(fā)細胞焦亡后致機體產生大量的IL-1β和IL-18[9]。目前，國內外未見CARDS Tx/NLRP3/IL-1β、IL-18通路與SMPP相關的臨床研究報道。

本研究發(fā)現，CARDS Tx與NLRP3在血清和BALF樣本中均呈顯著正相關，與Xia等[10]使用重組CARDS Tx處理THP-1細胞后NLRP3、IL-1β基因表達增加的研究結果一致，表明MP入侵人體后釋放的CARDS Tx可以激活NLRP3，具體的激活機制仍需開展深入研究。

Li等[11]比較MPP患兒與肺部無炎癥改變的支氣管異物患兒的BALF中CARDS Tx水平，發(fā)現MPP患兒BALF中CARDS Tx水平明顯增高。國內亦有研究表明，MP感染后具有喘息癥狀患兒的血清CARDS Tx水平高于無喘息癥狀患兒，表明CARDS Tx參與氣道的局部損害[12]。本研究比較了SMPP患兒患側和對側BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平，發(fā)現上述4個因子的表達患側均顯著高于對側，進一步說明CARDS Tx是誘發(fā)SMPP患兒局部肺損傷的重要因素，而NLRP3/IL-1β、IL-18通路是CARDS Tx介導SMPP患兒局部肺損傷的重要致病機制。

本研究檢測了MPP組、SMPP組、對照組血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18的水平，4個因子的比較結果均為SMPP組>MPP組>對照組，說明MP釋放的CARDS Tx可穿過呼吸道上皮屏障進入血液循環(huán)，并激活NLRP3/IL-1β、IL-18炎性通路，介導MPP的發(fā)生。CARDS Tx在SMPP患兒的血液循環(huán)中表達水平顯著高于MPP患兒，表明大量CARDS Tx被釋放入血后過度激活NLRP3/IL-1β、IL-18通路對SMPP的發(fā)生、發(fā)展具有重要致病意義。另外，筆者團隊推測血液循環(huán)中高水平的CARDS Tx很有可能是SMPP肺外組織并發(fā)癥的發(fā)病基礎，或許亦通過激活NLRP3/IL-1β、IL-18通路致SMPP患兒肺外組織炎性損傷，此觀點有待于進一步研究證實。

本研究中ROC分析表明，血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平是預測SMPP的有效指標，其中IL-1β的AUC值最高，其次為IL-18> NLRP3>CARDS Tx。CARDS Tx的敏感度稍低，但具有較高的特異性，其余3項指標的敏感度及特異性均較高，其中IL-1β和IL-18在臨床中是常用指標，多數醫(yī)院均可檢測，具有良好的實用性。若動態(tài)監(jiān)測血清中此4項指標的變化情況，可能對于判斷SMPP的治療效果具有一定價值，值得進一步論證。

綜上所述，CARDS Tx不僅可激活NLRP3/IL-1β、IL-18通路介導SMPP的發(fā)生，亦是參與SMPP患兒局部肺損傷的重要機制。另外，CARDS Tx很有可能通過血行途徑介導SMPP患兒的肺外組織損傷，有待進一步深入探究。本研究表明，血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平對于預測SMPP具有重要意義，動態(tài)觀察其變化趨勢或許對于評估SMPP的治療效果亦具有重要價值。本研究的不足之處是樣本量較小，今后仍需擴大樣本量繼續(xù)研究，以得到更多證據予以進一步證實。