多發性骨髓瘤患者T淋巴細胞特征及HIF-1α相關性分析

吳曉菲 孫 瓊 周芳芳 蔣 林

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是惡性漿細胞克隆性疾病，其分泌的單克隆球蛋白引起全身性損害，以骨質破壞、腎功能不全、貧血、高鈣血癥等為臨床表現[1]。MM患者中可觀察到一系列T淋巴細胞數量、分化和功能異常。Th17和Th22是新的CD4+T淋巴細胞亞群，在MM的疾病進展中發揮重要作用。Prabhala等[2]研究發現，MM患者外周血及骨髓單個核細胞中白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、IL-22和輔助性T細胞17(T helper cell 17, Th17)水平明顯高于健康人，促進體外和體內的骨髓瘤細胞生長，以及增強骨髓瘤細胞對骨髓間充質干細胞的黏附性，同時IL-17和IL-22聯合抑制健康供者外周血單個核細胞中Th1細胞因子的產生，削弱免疫反應[3]。最重要的是，Th17可通過CCL20-CCR6軸被募集到炎癥部位，IL-17上調核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)配體受體激活因子(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)的表達，后者促進破骨細胞形成；臨床上也同樣觀察到有溶骨性病變和非溶骨性病變患者中Th17細胞和IL-17的差異[4,5]。Th22細胞分泌的IL-22與腫瘤細胞上的IL-22受體結合，誘導信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)磷酸化，促進MM細胞的生長和耐藥性，IL-13通過促進骨髓間充質干細胞黏附分子和IL-6表達，間接增強MM細胞和間質細胞的黏附，調節MM腫瘤細胞的增殖和耐藥；臨床上也觀察到Th22細胞與分期呈正相關，并在患者獲得緩解后減少的現象[6]。

慢性炎癥刺激和腫瘤微環境影響下，大量T淋巴細胞受體激活誘導干擾素調節因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)、B淋巴細胞轉錄激活因子(B cell activating transcription factor, BATF)和活化T淋巴細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1, NFATc1)驅動T淋巴細胞耗竭。耗竭的T淋巴細胞表現為線粒體功能障礙，代謝活性降低，產生細胞因子能力明顯減弱，包括γ-干擾素 (interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-2等，并表達抑制性受體，包括程序性死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)、淋巴細胞激活基因-3 (lymphocyte activation gene-3, LAG-3)、T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3, TIM-3)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)、T淋巴細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains, TIGIT)和CD244等，最終抗原特異性T細胞缺失，出現腫瘤逃逸[7]。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是α亞基(通常為HIF-1α或HIF-2α)與β亞基(HIF-1β，也稱為芳基烴受體核轉位蛋白)一起組成。在缺氧條件下，HIF-1α不被蛋白酶體降解，被轉運到核內與HIF-1β形成二聚體，與缺氧反應元件結合，激活下游多種基因轉錄，發揮重要的生物學作用。在缺氧條件下，HIF-1α結合的某個缺氧反應元件(hypoxia-responsive element, HRE)在Th17轉錄因子視黃酸受體相關孤兒受體-γt(orphan nuclear receptor ROR gammaT, RORγt)的近端，誘導Th17分化，并促進Treg轉錄因子叉頭框p3(forkhead box protein 3, Foxp3)蛋白降解，通過以上機制上調自身免疫性腦膜炎模型中Th17/Treg比值，介導疾病進展[8]。另一方面，在腸道炎癥相關研究中發現HIF-1α與IL-22的啟動子結合，促進Th22轉錄因子芳香烴受體(Ah receptor nuclear translocator protein, AhR)表達，Th22分化和IL-22產生[9]。然而，關于MM中HIF-1α的表達，及其與T淋巴細胞分化相關性的研究較少。

本研究利用MM患者的骨髓活檢切片標本并通過免疫組化技術檢測HIF-1α在MM中的表達水平，并通過流式細胞術檢測Treg、Th17和Th22細胞分化水平，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測T淋巴細胞中T淋巴細胞耗竭相關基因表達，分析患者臨床特征、HIF-1α表達水平、T淋巴細胞分化特征之間的相關性，旨在為深入研究MM免疫逃逸提供新的視角和更多的實驗證據。

對象與方法

1.材料與儀器：抗CD4-FITC、抗Foxp3-PE、抗CD25-APC、抗IL-17A-PE、抗IL-22-PE均購自美國eBioscience公司；兔抗人HIF-1α抗體購自武漢Bioswamp公司；MaxVision TM HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。固定破核劑購自美國BD公司；SYBR快速qPCR試劑盒購自巴塞羅那Biosystems公司；Oligo (dT)18 Primer TaKaRa 3806、PrimeScript Ⅱ RTase、Recombinant Rnase Inhibitor均購自日本TaKaRa公司；10mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸預混液購自北京索萊寶科技有限公司；人全血單個核細胞分離液購自天津TBD公司。儀器：GE48527型PCR儀購自杭州柏恒科技有限公司；CFX-Connect 96型實時熒光PCR儀購自美國伯樂公司；NovoCyte型流式細胞儀購自美國艾森公司。

2.研究對象：收集2021年1月～2022年2月華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院收治的9例MM患者和3例缺鐵性貧血(iron deficiency anemia, IDA)患者的病例資料，分別納入MM組和IDA組。所入選MM患者均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南》診斷標準，IDA患者均符合缺鐵性貧血專家共識標準，并排除合并腫瘤的患者[10，11]。本項目通過華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院醫學倫理學委員會審批[倫理審批號：院-市衛健委-倫2021(16)；WHZXKYL2022-006]，參與患者均簽署知情同意書。MM組患者中，男性5例，女性4例，患者中位年齡為69(55，81)歲，發病年齡高峰為65～75歲，IDA組患者中，女性2例，男性1例，患者中位年齡為36(33，74)歲。疾病分型：IgG型6例，IgA型2例，輕鏈型1例。按照國際分期系統(International Staging Systyem, ISS)進行疾病分期，Ⅰ期3例，Ⅱ期2例，Ⅲ期4例；按照DS分期(Durie-Salmon, DS)進行疾病分期，ⅡA期3例，ⅢA期4例，ⅢB期2例。結合MM患者初診時頭顱、骨盆X線片、以及胸腰椎CT統計每位患者直徑≥5mm獨立溶骨性骨質破壞的部位數量，詳見表1。

3.免疫組化方法：應用Maxvision法對兩組患者骨髓病理進行HIF-1α免疫標記，DAB顯色，蘇木精復染，通過顯微鏡拍照，Leica Application Suite圖象系統采集樣本相關部位。蘇木精染細胞核為藍色，DAB顯出陽性為棕黃色。

4.流式細胞術：(1)Treg：取各組外周血樣本，1×106個細胞，100μl 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸后，每管加入5μl CD4和CD25抗體，4℃避光孵育30min。洗滌后每管加入固定劑1ml，重懸細胞，避光孵育20min離心后每管加入破膜劑1ml，重懸細胞，避光孵10min后，離心重懸細胞，每管加入5μl的Foxp3抗體，4℃避光孵育45min。400μl的PBS重懸細胞，4℃避光保存，上機檢測。(2)Th17、Th22：取各組外周血樣本，1×106個細胞，1ml的細胞培養液重懸，每管加入2μl的刺激阻斷合劑佛波酯(PMA，終濃度50ng/ml)和離子酶素(Ionomycin，終濃度2μg/ml)，高爾基體阻斷劑莫能菌素鈉(Monensin sodium，終濃度3μg/ml)，在37℃、5%CO2培養箱中共培養6h。洗滌后，加入2ml流式染色緩沖液洗滌1次，離心重懸細胞，每管加入5μl CD4抗體避光孵育；每管加入固定劑1ml，重懸細胞避光孵育并離心后，每管加入破膜劑1ml，重懸細胞避光孵育，洗滌離心后，每管加入5μl的IL-17、IL-22抗體，4℃避光孵育45min。重懸細胞，上機檢測。使用NovoCyte分析軟件分析實驗結果。

5.實時熒光定量聚合酶鏈反應：使用Trizol分離細胞總RNA，使用TaKaRa試劑盒反轉錄RNA形成cDNA。加入對應基因引物(表2)，使用美國Bio-Rad公司熒光定量PCR儀進行實時PCR。使用比較性循環數(Ct法)測量基因的mRNA表達水平，以內參基因GAPDH表達為基準值，將目的基因表達值標準化為相對mRNA表達水平。

表2 PCR引物序列

結 果

1.HIF-1α在MM患者中的表達：MM患者的骨髓活檢組織中，HIF-1α主要表達在間質組織中，少數在細胞質中(圖1)。6例行骨髓活檢的MM患者中，4例HIF-1α陽性率平均水平為12.00%±9.55%，1例為10%～20%，1例在30%以上，3例IDA患者骨髓活檢組織中，HIF-1α陽性率平均水平均為5.31%±1.14%。在MM患者骨髓標本中，HIF-1α陽性率明顯高于IDA患者(t=1.95，P=0.016)。

圖1 免疫組化法檢測骨髓活檢組織中HIF-1α的表達(DAB染色，×200)A.多發性骨髓瘤患者；B.缺鐵性貧血患者

2.Treg、Th17和Th22占CD4+T細胞中的比例：

MM組患者與IDA組患者外周血中， Treg、Th17細胞占CD4+T細胞中的比例差異均無統計學意義(P=0.975，P=0.685)，MM組患者外周血中，Th22占CD4+T細胞中的比例明顯高于IDA組(P=0.037，圖2)。MM組患者外周血中Th17/Treg比值明顯高于IDA組(P=0.006，表3)。

表3 外周血中Th17、Treg和Th22占CD4+T細胞百分比

圖2 流式細胞學檢測外周血中Treg、Th17和Th22占CD4+T細胞百分比A.多發性骨髓瘤患者；B.缺鐵性貧血患者；1.Th17；2.Treg；3.Th22

3.MM患者中T淋巴細胞耗竭相關基因表達：MM患者的T淋巴細胞中，NFATc1擴增水平明顯高于IDA患者(P=0.019)。同時，IRF4、轉錄因子Helios、B淋巴細胞誘導成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1)、轉錄因子T-bet的擴增水平在MM組和IDA組患者之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05，表4)。

表4 T淋巴細胞耗竭相關基因表達水平

4.Pearson相關性分析：Pearson相關性分析結果顯示，在MM患者骨髓中，HIF-1α表達水平與Th17/Treg比值之間呈正相關，但差異無統計學意義(r=0.538，P=0.270，圖3A)，HIF-1α表達水平與Th22占CD4+T細胞百分比之間呈明顯正相關(r=0.982，P=0.001，圖3B)。Th17/Treg比值與MM患者的溶骨性病變之間呈正相關(r=0.879，P=0.009，圖3C)。

圖3 HIF-1α與Th17/Treg比值、Th22以及Th17/Treg與骨損害的相關性分析A.HIF-1α與Th17/Treg比值；B.HIF-1α與Th22；C.Th17/Treg比值與骨損害

討 論

MM患者體內T細胞分化水平與健康人存在明顯差異。部分研究表明，MM患者中Treg細胞分化增多，而Th17細胞分化減少，參與到意義未明的單克隆球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)向MM進展的過程中[12]。另一部分學者研究表明，MM患者中Th17細胞、Th22分化及IL-17A、IL-22水平明顯高于健康對照組，兩者均能促進MM細胞增殖、黏附，與較差的疾病預后密切相關，其中Th17可通過誘導破骨細胞活性而促進溶骨性病變形成[5,6,13]。高水平的TGF-β，相對低水平的IL-6條件下，Foxp3占主導地位，推動T細胞從Treg/Th17向Treg傾斜。另一方面，低水平TGF-β，而高水平的IL-6激活STAT3，Foxp3對RORγt轉錄活性的抑制作用削弱，從而推動T淋巴細胞向Th17方向分化，因此Th17/Treg動態平衡是維持正常免疫功能的關鍵[14]。本研究發現，MM組患者外周血中Th17/Treg向Th17細胞分化方向傾斜，Th22細胞分化也明顯高于IDA組，提示監測Th17/Treg和Th22可為發現疾病進展提供關鍵線索。

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)具有單克隆抗體的抗原識別域和細胞內T淋巴細胞信號域，在結合特異性抗原后可直接發揮腫瘤殺傷作用，主要效應細胞為CD8+T細胞，靶向識別B淋巴細胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)的CAR-T細胞在臨床上已獲得重大突破，維持CAR-T細胞的持續性的靶向殺傷活性是進一步改善治療效果的關鍵[15]。然而，Tan等[16]研究發現，MM患者外周血和骨髓中耗竭表型T淋巴細胞，即表達PD-1、TIM-3的T淋巴細胞均顯著增加，尤其在CD8+T細胞群中更為明顯，而治療后患者耗竭表型T淋巴細胞有所減少。腫瘤微環境中的髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)可通過高表達PD-L1、CD80，分泌TGF-β和IL-10誘導T淋巴細胞耗竭[17]。慢性炎癥環境下，轉錄因子IRF4、BATF和NFATc1激活也是T淋巴細胞耗竭的重要機制[7]。本研究發現，MM患者外周血T淋巴細胞中NFATc1表達水平較高，而其他耗竭相關基因IRF4、Helios、Blimp-1、T-bet水平無明顯差異，還需要進一步擴大樣本量，分析CD8+T細胞的抑制性表型，評估MM患者的T淋巴細胞耗竭程度。骨髓微環境中巨噬細胞的STAT3以及IL-17通過上調NFATc1表達，促進破骨細胞分化和增殖，破壞骨穩態[18,19]。MM患者T淋巴細胞中NFATc1的激活為進一步探究MM患者溶骨性病變機制提供思路。

在MM中，HIF-1α主要通過調節VEGF、BFGF、Ang-2等血管新生相關的因子，促進骨髓瘤血管新生而影響腫瘤生長[20]。炎癥性疾病的相關研究表明，HIF-1α還可與缺氧反應元件結合，誘導下游轉錄因子激活，調節Th17和Th22細胞分化[8,9]。而關于MM中HIF-1α對免疫細胞的調節作用甚少研究。本研究結果提示，MM患者的骨髓活檢組織中高表達HIF-1α，與Th17/Treg比值、Th22百分比呈一定的正相關，Th17/Treg和溶骨性病變程度呈明顯正相關。HIF-1α可通過多種途徑調節線粒體氧化能力、氧化磷酸化、生物發生、凋亡、裂變和自噬，而線粒體功能障礙是T淋巴細胞耗竭、衰老的元兇[21]。HIF-1α與T淋巴細胞線粒體功能障礙之間的關系和內在機制是下一步研究的方向。

綜上所述，MM患者Th17/Treg、Th22水平升高，T淋巴細胞耗竭相關基因表達水平上調，表明MM患者的T淋巴細胞分化及功能狀態異常；骨髓中高表達的HIF-1α與異常的T淋巴細胞分化狀態相關，HIF-1α調節T淋巴細胞分化和功能的內在機制的深入研究為提高MM CAR-T細胞療效提供了新的可能性。