基于GPSM2的PDTX模型在胰腺癌個體化診治中的應用

林海敏 黨勝春 郄吟吟 胡 蓉

胰腺癌的發生率和病死率呈現逐年上升的趨勢[1]。胰腺癌患者中90%的病理類型是胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，胰腺癌患者可手術率只有20%，5年生存率低于5%，1年生存率約17%，目前在成人腫瘤中仍是預后最差的一種[2～4]。

從20世紀90年代起陸續建立了各種腫瘤細胞體外藥敏模型，包括細胞株移植瘤模型(cell-line-derived xenograft，CDX)及人源腫瘤異種移植(patient derived tumor xenograft，PDTX)模型等用于腫瘤個體化治療藥效學檢測。《胰腺癌綜合診治指南(2018版)》提出，PDTX模型在胰腺癌中的應用為胰腺癌個體化診療提供思路[5]。PDTX很好地保留了患者原始腫瘤的基本特征、瘤內微環境、組織病理、遺傳及表型方面的特征，因而能較好地預測藥物的反應性[6～9]。

G蛋白信號調控因子2(G-protein signaling modulator 2，GPSM2)屬于GPCR家族。最初發現GPSM2在維持細胞紡錘體的正確定位、確保細胞對稱性分裂、參與細胞分裂的G2/M期調控發揮著重要作用[10～13]。筆者團隊前期研究表明，GPSM2在胰腺癌組織中過表達，且其表達程度與胰腺癌浸潤、轉移、腫瘤分化類型及預后有一定相關性[14]。本研究在設計PDTX模型驗證模型可行性的同時，亦旨在驗證以GPSM2作為目標靶的藥物是否能夠抑制PDTX模型胰腺癌細胞、組織的生長。

材料與方法

1.材料：Trizol試劑、MTT購自上海碧云天生物技術有限公司。蛋白酶抑制劑及BCA法蛋白含量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。羊抗兔IgG+HRP、羊抗鼠IgG +HRP 購自美國Jackson公司。兔抗-ki-67(ab16667)、兔抗-PCNA(ab92552)購自英國Abcam公司。RPMI 1640培養基及FBS夠自美國Gibco公司。羊抗兔IgG+HRP購自常州中美歆新生物科技有限公司，SYBGRE PCR MasterMix購自美國Invitrogen公司，sh-GPSM2慢病毒包裝購自和元生物技術(上海)股份有限公司，Tween-20購自中國BBI生命科學有限公司，BSA蛋白標準品購自加拿大Fermentas公司，PVDF膜購自美國Bio-Rad公司。5例胰腺癌組織樣本取自2019年1月～2020年12月入選標準為中國臨床腫瘤學會胰腺癌診療指南手術實施R0切除的患者，胰腺癌分期類型參照UICC/AJCC TNM 2017分期系統[5，15]。

2.胰腺癌PDTX模型的建立：選取4～6周齡體質量30g左右的裸鼠于SPF級屏障環境中，實驗前飼養3天以上適應基本環境[實驗動物許可證號：SYXK(蘇)2013-0036]。從手術中獲取入組患者腫瘤標本組織后，迅速保存在低溫的RPMI 1640培養基(其中含20%胎牛血清和0.05%鏈霉素)中，并盡快移植到小鼠體內。移植前剔除腫瘤標本中壞死、破碎的組織，將品相良好組織分割為約2mm×2mm×3mm大小，麻醉小鼠后，將處理好的腫瘤塊移植到小鼠皮下及腎囊膜，縫合切口。將剩余的組織進行石蠟塊包埋。待移植瘤長到合適大小后，進行取瘤、移植傳代。脫臼法處死荷瘤鼠后，將小鼠置于75%乙醇中浸泡2min，手術獲取腫瘤組織后，接種方法如上所述。重復上述步驟，至第3代后，待瘤體長至100～200mm3適時進行試驗，使用3～7代進行藥物實驗。

3.動物體內藥物敏感度測試：使用第3～7代的體質量約為30g胰腺癌PDTX模型小鼠進行療效評價實驗，當荷瘤小鼠瘤體體積為100～200mm3時，將小鼠使用隨機區組法隨機分為對照組、sh-GPSM2組(sh-GPSM2慢病毒，50mg/kg)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)化療組(20mg/kg)，每組各5只，瘤內給藥，每次溶劑劑量為1.5ml，每3天1次，治療2周。藥物干預2周之后，評估給藥組與對照組的相對腫瘤抑制率(tumor growth inhibition，TGI)，計算方法為：TGI=1-T/C，T/C代表給藥組的瘤體體積/對照組的瘤體體積。小鼠的體質量、體積每3天測量1次，小鼠腫瘤體積每3天測量1次。體積計算方法為：腫瘤體積(V)=(長徑×短徑2)/2。

4.RT-qPCR檢測：使用Trizol試劑從對照組、sh-GPSM2組藥物干預18天后的新鮮荷瘤中提取總RNA，分離提取mRNA后，采用三步法進行RT-qPCR，以GAPDH為內參。引物序列詳見表1。采用相對定量進行統計學分析處理，采用RQ=2-△△CT法計算GPSM2的相對表達量。

表1 RT-qPCR所使用的引物序列

5.Western blot法檢測：分別取對照組、sh-GPSM2組化療18天后的新鮮荷瘤各5個，剪碎，取適量組織加入500μl的基礎裂解液30min裂解，在冰上離心后取上清，紫外分光光度計測定細胞裂解液蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸制備蛋白樣品，-80℃冰箱保存。配置好電泳膠后上樣蛋白樣品緩沖液混合液、70V電壓電泳、100V冰水混合浴中轉膜、洗膜后一抗4℃孵育12h、TBST(即TBS+Tween)漂洗3次5min洗膜、二抗常溫孵育12h后同樣洗膜3次，通過ECL Reagent顯影后掃膜，使用Image J軟件測量灰度值，再進行統計學分析。

6.流式細胞術檢測：①胰酶消化細胞，離心后去上清，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)清洗；5×105個細胞量的懸液離心去上清，加入100μl的緩沖液中重懸；加入Annexin V和7-AAD各5μl，室溫避光孵育15min；加入400μl的結合緩沖液，低溫避光保存，1h內上機檢測；②將單細胞懸液2ml離心，棄上清；加入PBS洗滌、離心，再次棄上清；4℃下70%乙醇固定30min后離心，棄上清；PBS洗滌，再次離心；于500μl PBS中加入RNase A，37℃孵育30min，離心；用PBS洗滌，離心后加入PI于500μl PBS中，室溫避光孵育30min后進行檢測。

結 果

1.PDTX模型及腫瘤體積、重量變化：PDTX模型成功建立(圖1A)，sh-GPSM2組抑癌率為66.61%，5-FU化療組的抑癌率為72.76%(圖1B)。3組干預6天后，每3天再評估，發現sh-GPSM2組、5-FU化療組腫瘤生長受抑制。5-FU、sh-GPSM2組干預后，模型腫瘤體積明顯縮小(P<0.001)。小鼠體內腫瘤組織對sh-GPSM2制劑、5-FU反應性良好，且抑制腫瘤作用比較，差異無統計學意義(圖1C)。在sh-GPSM2、5-FU化療組與對照組間，實驗小鼠腫瘤瘤體的重量比較，差異有統計學意義(P<0.001，圖1D)。

圖1 小鼠模型、瘤體與參數A.小鼠胰腺癌PDTX模型；B.藥物干預后18天后各組瘤體組織標本；C.藥物干預不同天數各組平均腫瘤體積；D.藥物干預18天后各組平均腫瘤重量。與對照組比較，*P<0.001

2.RT-qPCR檢測應用sh-GPSM2制劑對GPSM2基因表達的影響：使用了sh-GPSM2制劑的實驗組較對照組中的胰腺癌腫瘤細胞GPSM2基因表達水平明顯下降(P<0.001，圖2)。

圖2 對照組及sh-GPSM2組的GPSM2相對表達水平

3.Western blot法檢測腫瘤組織中周期相關蛋白ki-67、PNCA表達水平：sh-GPSM2組、5-FU化療組與對照組比較，與對照組間ki-67、PNCA表達，sh-GPSM2、5-FU化療組的ki-67、PNCA的表達被抑制(P<0.05，圖3)。

圖3 Western blot法檢測周期蛋白表達對比A.使用Western blot法檢測不同分組腫瘤周期相關蛋白的表達情況；B.各組目標蛋白的相對表達水平

4.流式細胞術檢測PDTX腫瘤細胞凋亡和周期：5-FU化療組、sh-GPSM2組在S期的細胞百分比明顯升高，說明sh-GPSM2制劑能抑制細胞周期于S期(P<0.01，圖4中A、B)；對照組腫瘤細胞早期凋亡較少，5-FU化療組、sh-GPSM2組腫瘤細胞早期凋亡比例增加(P<0.01，圖4中A、C)。

圖4 流式細胞術檢測細胞凋亡與周期及統計分析A.流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡和周期；B.各組早期凋亡細胞百分比；C.各組停留于S期細胞百分比

討 論

PDTX能夠在同一時間內對多只鼠移植同一來源的腫瘤組織并保持腫瘤特征，也可以通過獲取不同發展階段的腫瘤建立對應階段的腫瘤模型，進行不同時期腫瘤細胞、分子改變所導致的腫瘤轉移、復發機制和耐藥性機制的研究[16]。PDTX能客觀模仿患者原發腫瘤，能夠比較好地還原患者原發病灶的微生態環境、腫瘤性質等，因此可針對特定的腫瘤篩選最合適、有效的抗腫瘤藥物[17]。

國內外多篇文獻報道，GPSM2與多種腫瘤的發生、發展關系緊密，包括肝癌、肺癌、乳腺癌[18～21]。筆者團隊前期的研究表明，GPSM2高表達的胰腺癌預后較差。本研究在建立模型的同時，利用在體胰腺癌動物PDTX模型，以GPSM2為切入點，驗證GPSM2作為治療靶標的可行性，sh-GPSM2制劑的實用性及抗耐藥性值得期待。

本研究中RT-qPCR檢測結果說明sh-GPSM2制劑能夠抑制GPSM2的表達水平，類似靶向藥物抑制PDTX模型個體腫瘤的生長，這與PDTX模型腫瘤對sh-GPSM2反應效果有相關性，sh-GPSM2制劑能夠使PDTX模型胰腺癌腫瘤體積縮小、重量下降，抑制PDTX模型個體腫瘤的生長。而對照組腫瘤體積增大更快、腫瘤增重更快，對照組的周期相關蛋白ki-67、PNCA表達都較sh-GPSM2組高，sh-GPSM2制劑與5-FU能夠抑制周期相關蛋白的表達。sh-GPSM2組的腫瘤細胞停留于S期細胞比例增多，且早期凋亡細胞比例增多，推斷這兩種藥物干預均能夠對PDTX胰腺癌細胞的細胞周期有抑制作用，能夠促進癌細胞早期凋亡。驗證了GPSM2能夠促進腫瘤細胞增殖，參與細胞周期調控，GPSM2在參與細胞分裂的G2/M期發揮了重要的功能。

本研究建立了胰腺癌患者病理來源的PDTX模型，使用藥物治療后，可反映治療藥物對胰腺癌腫瘤的影響，通過分析PDTX模型裸鼠的腫瘤生長速度、體積、周期相關基因及蛋白表達、細胞凋亡等情況，對治療藥物的有效性做出判斷。使用sh-GPSM2制劑靶向治療可顯著抑制PDTX模型中胰腺癌細胞的生長，sh-GPSM2制劑可能作為一種新型胰腺癌靶向化療藥物等待開發，但是其具體的不良反應需要進一步的實驗研究。另外，后期研究中，共同應用sh-GPSM2制劑與5-FU、胰腺癌靶向治療藥物、常規化療藥物如吉西他濱等進行研究，檢測它們是否有協同作用，以獲得更好的胰腺癌治療方案，在低劑量藥物治療、更少的不良反應同時獲得更好的療效。在將來臨床應用過程中，本實驗能指導胰腺癌患者在需要化學干預早期就篩選出有效性、安全性最佳的治療方案。

綜上所述，胰腺癌模型中的GPSM2高表達者增長速度較快，抑制GPSM2的表達可以抑制PDTX模型腫瘤的生長。故而可以在病患確診胰腺癌早期，使用PDTX模型篩選、驗證sh-GPSM2制劑這種藥物的有效性，通過對PDTX模型治療后反應的監測，以及對模型中細胞的一系列增殖情況的研究，獲得的結果能指導建立sh-GPSM2制劑敏感的胰腺癌患者的個體化診療方案。