基于非靶向代謝組學方法探索兒童Graves病代謝模式的研究

夏 秦 陳臨琪 宋浩潔 陳秀麗 謝蓉蓉 王鳳云 吳海瑛 孫 輝 張丹丹 陳 婷

Graves病(Graves′ disease，GD)是由于促甲狀腺激素受體抗體(thyroid stimulating hormone receptor antibody, TRAb)刺激甲狀腺分泌過多甲狀腺素所致，是引起兒童甲狀腺功能亢進(以下簡稱甲亢)的主要原因[1]。甲狀腺素(thyroid hormone，TH)是調節人體代謝、提高組織耗氧量、促進骨骼生長發育、促進神經細胞分化與發育以及影響其他組織功能的激素。甲亢狀態下，TH分泌過多，增加靜息能量消耗，使患者體重下降。還促進三大營養物質，即蛋白質、脂肪和糖的代謝，如加速蛋白質的合成與分解，增強膽固醇和脂肪的合成與分解，增加糖異生等[2]。此外，研究還表明，TH還能影響核苷酸等代謝途徑，尤其是增加嘌呤代謝來維持ATP平衡[3]。

既往關于GD對體內代謝影響的研究大多聚焦于某一種或一類代謝產物及其通路，且以成人為主，尚無GD兒童非靶向代謝組學的研究。本研究利用非靶向代謝組學技術超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF/MS)檢測了GD兒童體內代謝通路模式的變化，為深入理解GD代謝過程打下了基礎，同時為指導GD兒童日常飲食及改善GD兒童病情提供理論依據。

對象與方法

1. 研究對象：選取2017年3月～2018年10在蘇州大學附屬兒童醫院初診為GD的30例患兒作為GD組，同時收集年齡與性別相匹配的30例健康兒童作為對照組。GD診斷參考文獻[4,5]，診斷標準包括：①符合甲亢臨床癥狀和體征；②血清促甲狀腺激素濃度降低，甲狀腺激素濃度升高；③TRAb陽性；④甲狀腺超聲示甲狀腺內血流增加。排除標準包括：①肝功能異常、心血管并發癥或其他內分泌疾病，尤其慢性淋巴細胞性甲狀腺炎早期甲亢型(TRAb陰性且超聲顯示甲狀腺腫，回聲不均，可伴多發性低回聲區域或甲狀腺結節)；②另外為了避免性激素對代謝物的影響，受試者均為青春期前兒童。通過Tanner分期評估青春期發育，只有睪丸體積小于4ml的男孩和乳房發育為Tanner Ⅰ期的女孩被納入研究[1]。本研究已經蘇州大學附屬兒童醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：2020CS020)，在研究對象或其監護人簽署知情同意書的基礎上，進行血樣本的采集。

2.一般資料及臨床指標：本研究收集就診時患兒年齡、性別、體重、甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體以及部分生化指標。甲狀腺功能、抗體及生化指標均利用電化學發光免疫分析法在蘇州大學附屬兒童醫院實驗室進行檢測。于晨8:00～9:00時抽取空腹靜脈血2ml，放置-80℃保存，待集中檢測。

3.質譜法檢測低分子物質：采用UHPLC-QTOF/MS測定血清中的低分子代謝物水平。

4.儀器與試劑：超高效液相(1290UHPLC，購自美國Agilent公司)；高分辨質譜(Triple TOF 6600，購自AB Sciex公司)；離心機(Heraeus Fresco17，購自美國Thermo Fisher Scientific公司)；天平(BSA124S-CW，購自德國Sartorius公司)；純水儀(明澈D24 UV，購自德國Merck Millipore公司)；超聲儀(PS-60AL，購自深圳市雷德邦電子有限公司)；色譜柱(ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1×100mm，購自美國Waters公司)。實驗用甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水購自CNW Technologies公司，L-2-氯苯丙氨酸購自上海恒柏生物科技有限公司，實驗用水為純水。

5.實驗過程：取100μl樣本，加入400μl含有內標的提取液(甲醇乙腈體積比=1∶1,內標濃度2μg/ml)，渦旋混勻30s；超聲5min(冰水浴)；零下20℃靜置1h；將樣本4℃、12000r/min離心15min；取出425μl上清于EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入100μl提取液(乙腈水體積比為1∶1)復溶；渦旋30s，冰水浴超聲10min；將樣本4℃、12000r/min離心15min；取出60μl上清于2ml 液相色譜質譜法(liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS)進樣瓶中，每個樣本各取10μl混合成QC樣本，再取60μl進行UHPLC-QTOF-MS分析。

結 果

1.一般資料分析：GD組和對照組的性別、年齡比較，差異無統計學意義。GD組體重明顯低于對照組。GD組游離甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(free tetraiodothyronine，FT4)平明顯高于對照組，TSH水平明顯低于對照組。本研究已排除肝功能異常受試者，但GD組谷丙轉氨酶水平明顯高于對照組，總膽紅素、直接膽紅素水平在兩組間比較，差異無統計學意義。GD組膽固醇水平明顯低于對照組，詳見表1。

表1 GD組和對照組的一般臨床特征和生化指標對比 .

2.差異代謝物的篩選：在所有參與者中共鑒定出730種代謝物，首先進行PCA，PCA得分圖顯示對照組和GD組的聚類，正離子模型和負離子模型的累積適應度(R2值)分別為0.52和0.53。對第一主成分進行OPLS-DA建模分析，OPLS-DA得分圖的結果分析表明，正離子模式(R2X=0.178，R2Y=0.895，Q2=0.727)和負離子模式(R2X=0.152，R2Y=0.86，Q2=0.669)下兩組樣本區分非常顯著。篩選第一步t檢驗P值小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的VIP來源>1.5，且該物質FC>1.2或<0.83進行篩選，共篩選出48種差異性代謝物，與對照組比較，GD組表達量上升的代謝物有35種，下降的代謝物有15種，詳見表2。

表2 GD組和對照組的差異性代謝物

3.差異代謝通路分析：通過KEGG數據庫找出顯著代謝通路，利用P<0.05且impact>0.05作為條件，篩選出主要差異代謝通路(表3)。GD組以氨酰基-tRNA生物合成，嘧啶代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，苯丙氨酸和酪氨酸代謝等通路發生改變最為顯著。

表3 GD組和對照組的主要差異代謝通路

4.差異代謝物與兒童GD臨床指標相關性分析：在GD組中，將差異性代謝物水平與其甲狀腺功能及自身抗體水平進行Spearman相關性分析。根據P<0.05、r>0.4作為條件進行篩選，發現差異代謝物中3個與TPOAb相關，1個與TRAb相關，3個與TGAb相關，1個與TSH相關，3個與總三碘甲狀腺原氨酸(total-triiodothyronine,TT3)相關，4個與總甲狀腺素(tatalthyroxine,TT4)相關，2個與FT3相關，8個與FT4相關,詳見圖1。

圖1 GD組差異代謝物與甲狀腺功能及自身抗體的相關性分析

討 論

本研究利用了非靶向代謝組學技術檢測并分析了GD兒童體內代謝通路模式的變化。結果共鑒定出730種代謝物在兩組之前存在差異，并從中篩選出48個顯著性差異性代謝物，它們主要來自氨基酸代謝、脂質代謝、三羧酸循環及核苷酸代謝等通路。

氨基酸是蛋白質的基本組成單位，也是合成某些激素、神經遞質及核苷酸等含氮物質的底物。本研究發現多種氨基酸在GD組升高，以及一些氨基酸代謝通路的改變。本研究發現氨基酰-tRNA生物合成途徑發生顯著變化，與既往成人研究結果相同，即甲亢狀態下，蛋白質合成及代謝增加[6,7]。

色氨酸屬于必需氨基酸，也是含有苯環的芳香族氨基酸之一，可通過影響氨基酸轉運系統T干擾細胞對T3的攝取[8]。研究發現，色氨酸可以劑量依賴的方式抑制小鼠胸腺細胞對T3的攝取[9]。色氨酸還是合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)和5-羥色胺(5-HT)等的重要前體。本研究發現，色氨酸血清水平在GD組中明顯升高且其代謝通路發生改變。色氨酸在體內主要經犬尿氨酸途徑進行代謝，最終生成NAD，后者是介導各種氧化還原反應的重要輔酶，促進糖、脂肪和氨基酸的代謝，參與能量的合成。

既往研究顯示，TH能提高色氨酸向NAD的轉化，且不通過犬尿氨酸途徑，而是通過氨基羧酸-半醛脫羧酶催化所致。本研究結果與既往結果一致，未檢測到犬尿氨酸通路中任何底物的升高[10]。此外，GD組5-HIAA略升高，表明5-HT代謝途徑增強，這與既往研究一致[11,12]。由于5-HT在大腦發育、情緒調節、應激反應和精神疾病風險中起著核心作用，推測其與甲亢患兒的情緒調節有關[12]。本研究還發現，GD患兒色氨酸水平與TGAb水平呈負相關，提示色氨酸在GD自身免疫過程中發揮調節作用，這可能與色氨酸合成吲哚途徑是一種有效的免疫抑制機制相關[13]。因此，色氨酸代謝在GD發病機制中起重要作用，補充或限制色氨酸攝入對GD的影響還有待進一步研究。

與既往研究成人GD患者的研究一致，本研究只發現十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸等游離脂肪酸在GD組明顯降低，這可能由于檢測方法UHPLC-QTOF/MS技術對非極性脂肪酸的檢測存在一定的局限性[7]。本研究還發現二氫鞘氨醇(sphinganine)在GD組降低，而1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)在GD組升高，且與TT4水平呈正相關。在鞘脂代謝中，二氫鞘氨醇是合成鞘氨醇前體，鞘氨醇在鞘氨醇激酶催化下產生S1P。S1P可促進細胞生長和存活，但S1P在炎癥中的作用尚無明確定論，既可以上調類風濕關節炎滑膜細胞中促炎核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)的表達，在銀屑病小鼠模型中也可以具有抗增殖和抗炎作用，它不僅可以使表皮厚度減少，還可以適度減少耳朵皮膚中的炎性細胞流入和水腫[14,15]。S1P與5個G蛋白偶聯受體(S1PR1～S1PR5)之一結合，在先天性和適應性免疫反應中起重要調節作用，該信號通路可以作為自身免疫性疾病治療的靶點[16，17]。如免疫抑制劑芬戈莫德(fingolimod，FTY720)是一種鞘氨醇類似物，作為S1PR拮抗劑被用于多發性硬化的治療[18]。另外，S1P裂解酶抑制劑也可以緩解類風濕關節炎小鼠的關節炎癥及破壞，目前正在臨床實驗中[19]。

近年來，Han等[20]研究發現，Sphk1/S1P/S1PR1信號轉導參與小鼠自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)的發展，表現為Sphk1/S1P/S1PR1通路成分表達上調，AIT組中炎癥相關細胞亞型(如Th1、Th17和Tfh)的比例升高，并且這些細胞亞型在使用FTY720后降低，可見阻斷Sphk1/S1P/S1PR1信號轉導以改善AIT的嚴重程度，為AIT有望成為治療靶標提供證據。綜上所述，推測FTY720可能通過抑制Sphk1/S1P/S1PR1信號通路用于自身免疫性疾病GD的治療，但是尚需進一步研究進行驗證。

研究發現，TH不僅可以促進白色脂肪褐變，也可以通過調節環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的產生促進棕色脂肪中的解偶連蛋白1(uncoupling protein 1，CP1)合成來增加產熱[21,22]。棕色脂肪細胞具有積累和氧化琥珀酸的能力，前者在人體中的含量隨著年齡的增長而降低[23,24]。本研究發現，琥珀酸水平在GD組升高，因此推測琥珀酸升高可增加GD兒童產熱作用且可能較成人更加明顯。

GD組患兒核苷酸代謝通路增強，嘌呤代和嘧啶代謝產物水平均有明顯升高。既往研究發現，嘌呤代謝產物尿酸水平在GD組明顯升高[25, 26]。此外，甲亢患者肌肉耗能增加，核苷酸循環增加可以為ATP快速提供底物，因此嘌呤核苷酸循環加速被認為是防止ATP能量快速失衡的保護機制[3]。有關嘧啶代謝的代謝增強推測可能是由于核苷酸循環增加所致，但目前研究甚少。

綜上所述，本研究發現，與對照組比較，GD兒童代謝模式發生顯著改變。本研究是首次利用非靶向代謝組學技術分析青春期前兒童GD代謝組學改變，有助于全面理解GD兒童代謝模式變化，為加深兒童GD的理解和治療打下基礎，但仍需要擴大樣本量及開展動物實驗予以進一步驗證。