RGD修飾的低分子量魚精蛋白/CpG ODN復合物的制備及抗腫瘤活性

劉佳佳 蘇秋東 伊 瑤 畢勝利

CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide, CpG ODN)是含非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸，能與B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞表面的TLR9受體結合[1]。通過激活下游多種信號通路，誘發免疫級聯反應，刺激機體產生強烈的先天性免疫應答及Th1型細胞免疫應答[2, 3]。CpG ODN強烈的免疫激活能力，使其在腫瘤治療方面表現出極大的研究價值[4]。研究表明，CpG ODN單獨使用時即可殺傷腫瘤細胞，發揮抗腫瘤效應，但其誘導的免疫應答強度尚不足以消除腫瘤，而將CpG ODN與其他免疫增強劑或利用基因載體進行靶向給藥的方式可以顯著增強其腫瘤治療效果[5～8]。

細胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)是一類具有細胞膜穿透功能的小分子多肽，長度通常為6～30個氨基酸，結構上富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸[9]。CPP作為基因遞送載體可以攜帶多種生物大分子(蛋白、核酸、藥物、納米粒子等)進入細胞，在基因治療、藥物體內轉運等研究領域具有很大的研究價值[10～12]。低分子量魚精蛋白(low molecular weight protamine，LMWP)是由天然魚精蛋白酶解后分離得到的一種陽離子多肽，具有典型的穿膜肽結構[13]。LMWP富含精氨酸，其自身帶有的正電荷能有效結合并壓縮帶負電的核酸形成穩定的復合物[14]。同時LMWP攜帶核定位信號，有助于指導LMWP/核酸復合物向細胞核內轉運，提高細胞內化效果，是一種安全有效的基因遞送載體[15,16]。將LMWP作為載體介導抗腫瘤藥物遞送的研究已有報道，LMWP不僅能提高腫瘤治療效果，而且治療過程安全、不良反應小[17,18]。

本研究以腫瘤靶向序列RGD修飾的LMWP多肽作為載體，利用LMWP對核酸的結合特性裝載CpG分子形成納米復合物，通過檢測其理化性質、細胞內分布情況及對腫瘤細胞生長的影響，探討LMWP作為載體遞送CpG ODN的可能性，及其對提高CpG ODN腫瘤治療效果的作用。

材料與方法

1.試劑和儀器：CpG ODN和FAM修飾CpG ODN購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；RGD-LMWP購自南京金斯瑞生物科技有限公司；Dulbeccco′s Modified Eagle′s Medium培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；DiD熒光染料購自上海碧云天生物技術有限公司；實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。紫外凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購自廣州市明美光電技術有限公司；二氧化碳細胞培養箱、Multiskan GO多功能酶標儀購自美國Thermo公司；Nano-ZS粒徑分析儀購自英國Malvern公司。

2.細胞株：人子宮頸癌細胞株(HeLa)為中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所保存。采用含10%胎牛血清的DMEM 培養基于37℃、5% CO2的細胞培養箱中連續培養，取對數生長期的細胞進行相關實驗。

3.RGD-LMWP/CpG復合物的制備：將RGD-LMWP和CpG凍干粉分別用去離子水溶解，CpG質量濃度恒定為0.2mg/ml，按照RGD-LMWP與CpG質量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的比例，將CpG加入到等體積不同質量濃度的RGD-LMWP溶液中，渦旋混勻后室溫靜置30min，即獲得不同質量比的RGD-LMWP/CpG復合物。

4.RGD-LMWP/CpG復合物的凝膠阻滯分析：采用瓊脂糖凝膠電泳實驗分析RGD-LMWP對CpG的包裹能力。稱取適量瓊脂糖制備1%瓊脂糖凝膠(0.5μg/ml)，將制得的不同質量比RGD-LMWP/CpG復合物與上樣緩沖液混勻后進行電泳(90V，20min)，置于凝膠成像系統中觀察并拍照。

5.RGD-LMWP/CpG復合物的理化性質表征：取2ml制得的不同質量比RGD-LMWP/CpG復合物，使用激光粒徑分析儀對復合物的粒徑大小與zeta電位進行檢測。

6.腫瘤細胞攝取實驗：取對數生長期的HeLa細胞接種于24孔板中，在37℃、5% CO2培養箱中培養使細胞貼壁。將RGD-LMWP與帶有FAM熒光基團修飾的CpG按質量比為3∶1制備復合物，每孔加入含5μg CpG的復合物，在培養箱中孵育4h。棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗2次后，加入DiD熒光染料，繼續在培養箱中孵育30min，棄去培養基，用PBS漂洗2次后，使用倒置熒光顯微鏡下觀察熒光的分布情況。

7.抑制腫瘤細胞增殖實驗：采用CCK-8法評估復合物的抗腫瘤細胞增殖能力。將處于對數生長期的HeLa細胞接種于96孔板中(細胞密度為103個/孔)，在37℃、5% CO2培養箱中培養過夜使細胞貼壁。用DMEM培養基對RGD-LMWP/CpG(質量比為3∶1)復合物進行倍比稀釋，保證CpG的質量濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml。吸去96孔板中的原培養液，用PBS漂洗2次后，加入稀釋好的復合物溶液100微升/孔，在培養箱中繼續培養。培養24h后，向每孔加入10μl CCK-8溶液，在培養箱中孵育30min后，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度值，并按下列公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實驗孔(含有細胞的培養基、CCK-8、待測物質)；Ac為對照孔(含有細胞的培養基、CCK-8、無待測物質)；Ab為空白孔(不含有細胞和待測物質的培養基、CCK-8)。

結 果

1.RGD-LMWP多肽的純度鑒定：采用固相合成法合成RGD-LMWP多肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)，高效液相色譜分析以及質譜分析結果顯示，合成RGD-LMWP多肽的相對分子質量為3656.23kDa，純度為95.2%。對其進行溶解度測試，RGD-LMWP多肽可溶于超純水和PBS，詳見圖1、圖2。

圖1 RGD-LMWP的高效液相色譜分析

圖2 RGD-LMWP的質譜分析

2.RGD-LMWP/CpG復合物的凝膠阻滯結果：凝膠阻滯分析可以反映RGD-LMWP對CpG的包裹壓縮能力。游離CpG可與核酸染料結合，隨電場發生遷移，在紫外線照射下可觀察到明顯的熒光條帶；RGD-LMWP帶正電，可與CpG通過靜電吸附縮合成穩定的復合物，阻止CpG與熒光染料的結合。當RGD-LMWP/CpG的質量比<3時可觀察到條帶，說明CpG未完全被縮合，體系中仍有游離CpG在電場作用下發生遷移；隨著RGD-LMWP/CpG質量比的增大，LMWP對CpG的縮合能力增強，可遷移的游離CpG逐漸減少；當質量比≥3時，CpG完全被魚精蛋白包裹，無遷移現象發生，故觀察不到條帶，詳見圖3。

圖3 RGD-LMWP/CpG復合物的凝膠阻滯電泳圖泳道1.CpG；泳道2～6.RGD-LMWP/CpG的質量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1

3.RGD-LMWP/CpG復合物的表征：復合物的粒徑和表面電位對目的基因能否有效轉運至靶細胞具有重要的參考意義。通常粒徑為100～200nm，表面單位帶正電荷的顆粒更有利于細胞的內化[19]。采用激光粒徑分析儀對不同質量比RGD-LMWP/CpG合物的粒徑、zeta電位及多分散系數進行了檢測，結果顯示，隨著RGD-LMWP/CpG質量比的升高，復合物的粒徑由112.1±0.5nm升高至135.2±2.4nm，呈逐漸增大趨勢；而zeta電位的變化趨勢不明顯，在40mV左右。這表明RGD-LMWP和CpG可以通過靜電作用結合形成復合物，并在溶液中均勻分布，而且該復合物還具備被細胞攝取的有利條件。綜合考慮以上參數以及后續實驗劑量需求，本研究最終選擇以質量比3∶1形成的RGD-LMWP/CpG復合物(粒徑119.7±1.2nm，zeta電位47.9±0.5mV)作為研究對象繼續開展體外細胞實驗,詳見表1和圖4。

圖4 不同質量比RGD-LMWP/CpG復合物粒徑和電位的差異A.粒徑大?。籅.zeta電位

表1 不同納米復合物的粒徑分布和zeta電位比較

4.腫瘤細胞攝取實驗：將帶有FAM熒光基團修飾的游離CpG和RGD-LMWP/CpG復合物分別作用于HeLa細胞，根據HeLa細胞內是否有綠色熒光以及熒光強度進行細胞攝取效率的評價。倒置熒光顯微鏡結果顯示，CpG組HeLa細胞內的綠色熒光較少，說明HeLa細胞對游離CpG的攝取效率較低；RGD-LMWP/CpG(3∶1)復合物組的細胞內分布有大量綠色熒光，說明在細胞穿膜肽RGD-LMWP的轉運下，腫瘤細胞對CpG的攝取效率顯著增強，詳見圖5。

圖5 HeLa細胞對各組藥物的攝取情況(×400)A.游離CpG組；B.RGD-LMWP/CpG復合物組

5.抑制腫瘤細胞增殖實驗：采用CCK-8法比較不同濃度的RGD-LMWP/CpG(3∶1)復合物對HeLa細胞增殖能力的影響。結果顯示，將RGD-LMWP多肽單獨作用于HeLa細胞時，隨RGD-LMWP使用劑量的升高，HeLa細胞的增殖能力受到輕微影響，但并未出現明顯的細胞毒性，說明RGD-LMWP是一種相對安全的基因載體。與單獨使用CpG比較，RGD-LMWP/CpG復合物能夠顯著抑制腫瘤HeLa細胞的增殖，且使用劑量越高，抑制效果越明顯。當CpG使用劑量≤50μg/ml時，復合物組和游離CpG組的細胞存活率比較，差異無統計學意義；當CpG使用劑量>50μg/ml時，復合物組和游離CpG組的細胞存活率開始出現差異，且劑量達到100μg/ml時，兩組的細胞存活率分別為31.93%和80.70%(P<0.01)。這些結果表明，RGD-LMWP與CpG形成復合物后，可以有效地將CpG遞送至腫瘤細胞發揮抗腫瘤活性，是一種相對安全有效的給藥系統，詳見圖6。

圖6 RGD-LMWP/CpG復合物對Hela細胞的抑制作用

討 論

LMWP作為一種天然非病毒載體，可利用其跨膜功能攜帶多種外源性分子進入細胞，且不影響所攜帶分子的生物活性[17]。多項研究肯定了LMWP作為載體介導基因給藥的優勢，利用LMWP遞送FER-siRNA可有效抑制乳腺癌細胞的增殖[20]；LMWP還可以通過多種跨膜途徑增強藥物細胞內遞送和腫瘤穿透的效率從而改善耐藥型癌癥的治療效果[21]。為提高CpG的抗腫瘤能力，本研究利用LMWP的核酸結合特性，將其與CpG作用形成納米復合物，并對復合物的腫瘤治療效果進行實驗室評價。同時，為提高轉運的靶向性，本研究對LMWP進行了RGD(精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸)修飾，RGD序列可以靶向于整合素過表達的腫瘤細胞或腫瘤內皮血管，是一種常見的提高腫瘤藥物遞送效率的修飾方法[22,23]。

首先，為驗證RGD-LMWP和CpG能否通過靜電引力結合成復合物，本研究采用凝膠電泳對RGD-LMWP和CpG的結合能力進行了分析，結果顯示，當RGD-LMWP/CpG的質量比≥3時，已經檢測不到游離CpG的存在，說明通過簡單的靜電結合可以實現RGD-LMWP對CpG的完全縮合。對復合物粒徑、zeta電位和多分散系數的檢測說明RGD-LMWP與CpG結合后不僅能以顆粒狀態均勻存在，且具備被細胞攝取的有利條件。一方面，RGD-LMWP/CpG復合物表面攜帶的正電荷有利于其與細胞膜表面的負電基團結合而黏附于細胞膜上；另一方面，RGD-LMWP/CpG復合物的粒徑優勢100～200nm以及LMWP的跨膜轉運能力有利于其通過多種途徑被細胞內化，進入細胞發揮作用。

體外細胞實驗是檢測物質活性、評價藥效的基礎內容。將得到的RGD-LMWP/CpG(3∶1)復合物(粒徑119.7±1.2nm，zeta電位47.9±0.5mV)作用于腫瘤細胞分析其對細胞攝取效率和腫瘤細胞增殖能力的影響。與游離CpG比較，RGD-LMWP/CpG復合物進入腫瘤細胞的能力更強，對腫瘤細胞生長的抑制作用更明顯，這說明RGD-LMWP通過與CpG結合形成復合物，利用復合物的粒徑和電位優勢可以有效地將CpG輸送至腫瘤細胞中，繼而發揮抗腫瘤作用。但是，目前尚不清楚CpG是以與RG -LMWP結合成復合物的狀態還是從復合物中分離出來的狀態在細胞內發揮作用的，更多細胞動力學機制仍需開展進一步研究。

綜上所述，本研究成功采用陽離子多肽RGD-LMWP靜電結合CpG的方法制備得到了RGD-LMWP/CpG復合物，該復合物能實現CpG向腫瘤細胞內的有效傳遞，并發揮其抑制腫瘤細胞增殖的作用，為增強CpG的抗腫瘤效果提供了新的研究思路。