亞甲基藍對羅氏沼蝦組織結構、抗氧化系統及免疫能力的影響

敖士齊，翟 乾，紀 鵬，高煒峰，李 杰，張曉君，高曉建，姜 群

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

亞甲基藍又名次甲基藍、美藍，是一種人工合成的噻嗪類染料，作為孔雀石綠、硝基呋喃等禁藥的替代品被廣泛使用[1]，可以有效控制水產養殖中的爛鰓病、水霉病、紅嘴病、小瓜蟲病等常見疾病。與孔雀石綠相比，亞甲基藍的毒性較低，但是，近年來研究發現，亞甲基藍及其代謝物存在一定的毒副作用。例如，亞甲基藍可導致神仙魚(Symphysodonaequfasciatus)[2]、孔雀魚(Poeciliareticulate)[3]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[4]死亡，誘發天使魚(Pterophyllumscalare)魚鰾畸形[5]，損傷斑馬魚(Daniorerio)DNA結構[6]，對羅非魚(Oreochromismossambicus)造成應激現象[7]，對凡納濱對蝦腸道、肝胰腺組織造成病理損害[8]等。目前，歐盟、美國等國家和地區已經禁止亞甲基藍在食品動物生產中使用[9]，國內尚無相關法律和政策，水產養殖中亞甲基藍的使用缺乏有效的管理。

羅氏沼蝦(Macrobrachiurosenbergii)是我國重要的水產養殖經濟物種，具有生長快、個體大、食性廣、易馴養、適應性強、生產周期短等優點[10]。隨著羅氏沼蝦養殖密度和養殖規模的日益擴大，亞甲基藍等水產消毒劑的使用已不可避免，鑒于亞甲基藍的過量使用可對水產動物產生毒副作用，了解亞甲基藍對羅氏沼蝦的毒性效應，對于優化養殖生產中的使用劑量具有重要的實踐意義。本研究采用半靜水式方法開展急性毒性實驗，探究亞甲基藍對羅氏沼蝦的半致死濃度和安全濃度，并將羅氏沼蝦暴露于濃度為1/2 96 h LC50的亞甲基藍4 d，后轉移至清水養殖7 d，分析亞甲基藍對羅氏沼蝦組織結構、抗氧化系統及免疫能力的影響及可逆性，以期為羅氏沼蝦的規范養殖和安全用藥提供依據，并為亞甲基藍對甲殼動物的毒性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與樣品收集

實驗所用羅氏沼蝦來自揚州富源水產有限公司，個體健康、活力良好。隨機選取體長為(3.5±0.5)cm的羅氏沼蝦放入100 L的水族缸暫養，實驗用水為充分曝氣24 h的自來水，水溫為(25±1)℃，每日清理食物殘渣與糞便，日投喂兩次商品化飼料，暫養7 d后進行實驗，實驗前1 d停止投喂，采用半靜水式方法開展急性毒性實驗，每日更換藥液1次，日換水量50%。實驗選用分析純亞甲基藍(含量98.5%，福晨化學實劑有限公司)，使用蒸餾水將其配置為500 mg/L濃度的母液備用，設計6個亞甲基藍濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L)和一個空白對照組，每組設置三個平行，每個平行組隨機放入20尾羅氏沼蝦，每日統計并且記錄各組羅氏沼蝦存活情況，急性毒性實驗持續96 h。數據采用Excel2016處理，通過濃度對數—死亡率線型回歸方程，計算亞甲基藍對羅氏沼蝦的24、48、72和96 h的半致死濃度。采用特倫堡(Turubell)公式計算實驗藥品的安全濃度(SC)[11]，SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2。

為進一步探究亞甲基藍對羅氏沼蝦的毒性效應，將羅氏沼蝦暴露于濃度為1/2 96 h LC50的亞甲基藍4 d，去除亞甲基藍后清水養殖7 d，暴露實驗期間每日更換藥液1次，日換水量50%，不含亞甲基藍的清水養殖組為對照組，每組60尾羅氏沼蝦。于實驗的第0、1、2、4、7和11 d取樣，每個時間點取6尾蝦，解剖獲得羅氏沼蝦的肝胰腺、腸道和鰓組織，每尾樣品取部分組織采用Bouin’s溶液固定，用于組織病理損傷研究，剩余組織樣品液氮冷凍后于-80 ℃保存，用于酶活、基因表達分析。

1.2 組織病理損傷評估

經Bouin’s溶液固定48 h的肝胰腺、腸道和鰓組織，轉入濃度為75%的乙醇中保存。通過梯度酒精濃度脫水處理后，用石蠟包埋，石蠟切片機制片，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察并描述，拍攝主要病變部位。

1.3 生化指標測定

取-80 ℃保存的肝胰腺組織約100 mg，按比例加入生理鹽水，采用電動勻漿儀充分勻漿，按照南京建成生物工程公司試劑盒說明書，用酶標儀進行吸光度檢測，計算肝胰腺組織中丙二醛(MDA)和過氧化物(H2O2)含量，計算超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，評價亞甲基藍對羅氏沼蝦抗氧化系統和免疫因子的影響。

1.4 基因表達水平測定

取-80 ℃保存的肝胰腺組織約100 mg，液氮研磨后，采用Trizol法提取總RNA，采用1×TAE配置1%瓊脂糖凝膠，與6×Loading buffer混合后上樣，根據28 S和18 S條帶完整性判斷RNA質量。另取1 μL RNA用超微量紫外可見分光光度計(NanoReady Touch)檢測RNA 濃度，采用HiScript III RT SuperMix for qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)完成反轉錄合成cDNA。本次實驗中所用引物均使用Primer Premier 6.0軟件設計，引物序列信息見表1，以β-肌動蛋白(β-actin)和延伸因子-1α(Elongationfactors-1α,EF1α)基因作為內參，目標基因為熱休克蛋白(Heatshockprotei,HSP)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)、TOLL樣受體(Toll-likereceptors,TLR)、凝集素(Lectin,LEC)，采用GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行熒光定量PCR(qRT-PCR)反應，反應體系為：SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，用去離子水補足至20 μL，反應條件為：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，延伸60 ℃ 30 s，40個循環，所得到的結果采用2-ΔΔt法計算免疫基因的相對表達水平。

1.5 數據處理

免疫基因mRNA表達量及酶活數據采用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用Levene法進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性的條件下采用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析，采用SNK法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果

2.1 亞甲基藍對羅氏沼蝦的急性毒性

本實驗以羅氏沼蝦出現沉底，觸摸無反應且無心跳為死亡表征。研究發現，急性毒性實驗期間，對照組未發生個體死亡現象，而不同濃度亞甲基藍暴露實驗組，羅氏沼蝦出現不同水平的死亡現象。實驗初期，低濃度亞甲基藍(3.125、6.25和12.5 mg/L)處理組中羅氏沼蝦體色正常，活力與對照組無明顯差異，高濃度組亞甲基藍(25、50和100 mg/L)處理組中羅氏沼蝦出現應激現象，主要表現為無規則運動增強。隨著暴露時間的增加，羅氏沼蝦出現體色加深變藍，臥伏于水底等現象，直至死亡，死亡個體尾部肌肉泛藍，頭部發黑。亞甲基藍暴露導致的羅氏沼蝦死亡情況見圖1，相同藥物濃度脅迫下，羅氏沼蝦死亡率隨時間增加而升高，而同一時間點，亞甲基藍濃度越高羅氏沼蝦死亡率越高，亞甲基藍對羅氏沼蝦的毒性呈現明顯的劑量與時間效應。通過濃度對數—死亡率線性回歸方程，計算得到亞甲基藍對羅氏沼蝦的24、48、72和96 h的半致死濃度分別為209.7、54.7、6.1和2.8 mg/L，安全濃度為1.1 mg/L。

2.2 亞甲基藍對羅氏沼蝦的組織病理損傷

2.2.1 肝胰腺組織病理變化

圖1 不同亞甲基藍濃度下羅氏沼蝦的死亡率Fig.1 Mortality rates of M.rosenbergiiexposed to different methylene blue concentrations

未經亞甲基藍處理的羅氏沼蝦肝胰腺如圖2a所示，肝胰腺組織結構清晰，肝胰腺小管基膜完整管腔呈星型，細胞界限清晰，B細胞分布在肝小管周圍多成馬蹄形，R細胞有儲存能量物質的作用胞內可見大小不等的轉運泡，肝胰腺小管周圍存在少量結締組織所構成的基膜。1.4 mg/L亞甲基藍暴露4 d的羅氏沼蝦與對照組相比，少量肝胰腺小管管壁變薄管腔擴大刷狀緣消失，部分管腔嚴重變形呈不規則形狀，部分B細胞出現破裂，大量轉運泡消失(圖2b)。去除亞甲基藍并在清水中恢復7 d后，肝胰腺組織結構部分恢復，管腔出現刷狀緣，部分轉運泡出現(圖2c)。

圖2 亞甲基藍暴露對羅氏沼蝦肝胰腺的組織病理損傷Fig.2 Histological structure of hepatopancreas tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination

未經亞甲基藍處理羅氏沼蝦鰓組織如圖3a所示，鰓組織中鰓絲排列整齊均勻，鰓絲上皮細胞以及次級層狀上皮細胞結構完整形態正常，基部泌氯細胞致密均勻結構完整。1.4 mg/L亞甲基藍暴露4 d后，羅氏沼蝦鰓絲頂端次級層狀上皮細胞出現腫大，鰓絲基部出現空泡和細胞裂解(圖3b)。去除亞甲基藍并在清水中恢復7 d后，鰓絲基部基本恢復，但鰓絲頂端次級層狀上皮細胞依然膨大，未恢復對照組水平(圖3c)。

2.2.3 腸道組織病理變化

未經亞甲基藍處理羅氏沼蝦腸組織如圖4a所示，腸壁組織中黏膜層由排列緊密的柱狀上皮細胞構成，上皮細胞向內褶皺形成腸絨毛，腸絨毛表面模糊可見粘膜上皮，柱狀上皮細胞外側為環狀縱向肌層，最外側由漿膜包裹，組織整體未見明顯異常。1.4 mg/L亞甲基藍脅迫4 d后，腸壁變薄腸道萎縮，腸絨毛結構消失，部分柱狀上皮細胞缺失(圖4b)。去除亞甲基藍并在清水中恢復7 d后，腸絨毛結構消失癥狀仍然存在，柱狀上皮細胞部分缺失(圖4c)。

圖3 亞甲基藍暴露對羅氏沼蝦的鰓組織形態的影響Fig.3 Histological structure of gill tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination a：對照組鰓組織；b：亞甲基藍處理第 4 d 鰓組織；c：轉移至清水第 7 d 鰓組織；CC：泌氯細胞；EC：上皮細胞；SL：次級層狀上皮細胞；▲：鰓絲基部損傷出現大量空泡；●：鰓絲基部基本恢復；★：鰓絲次級層狀上皮細胞腫大。

圖4 亞甲基藍暴露對羅氏沼蝦的腸組織形態的影響Fig.4 Histological structure of gut tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination a：對照組腸道組織；b：亞甲基藍處理第4 d腸道組織；c：轉移至清水第7 d腸道組織；Ser：漿膜；Lum：腸道管腔；EPM：中腸柱狀上皮細胞；Msz：環狀縱向肌肉；▲：腸絨毛結構消失；●：柱狀上皮細胞缺失。

2.3 亞甲基藍對羅氏沼蝦的氧化應激損傷

1.4 mg/L亞甲基藍暴露導致羅氏沼蝦活性氧水平和抗氧化酶活性發生明顯變化(圖5)。亞甲基藍暴露導致SOD、GSH-Px酶活出現顯著下降，SOD在暴露2 d后出現顯著下降，在4 d達到最低，GSH-Px酶活于暴露后1 d出現顯著下降，在4 d下降至最低水平，清水恢復3 d后，SOD、GSH-Px酶活均恢復至略低于對照組活性水平，7 d后恢復至對照組水平。H2O2和MDA含量在亞甲基藍暴露后即出現積累，在暴露4 d后達到峰值，清水恢復7 d后，MDA含量逐漸恢復至對照組水平，H2O2含量仍高于對照組但差異不顯著。

圖5 亞甲基藍脅迫對羅氏沼蝦肝胰腺組織抗氧化系統的影響Fig.5 Effects of MB stress on the activities of antioxidant system in hepatopancreas of M.rosenbergiiT：亞甲基藍暴露組；C：對照組；“*”和“**”表示顯著差異(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。 下圖同。

2.4 亞甲基藍對羅氏沼蝦免疫系統的影響

如圖6所示，在1.4 mg/L亞甲基藍暴露后，羅氏沼蝦肝胰腺免疫因子堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性均受到嚴重影響，與對照組相比AKP在脅迫后1 d出現明顯下降，在2 d達最低點，脅迫4 d后出現上升趨勢，但顯著低于對照組，清水養殖3 d后AKP活性恢復至對照組水平。ACP與AKP趨勢基本相似，ACP在亞甲基藍暴露第2 d出現顯著下降，第4 d上升，轉移至清水3 d后活性低于對照組但差異并不顯著，清水養殖7 d后活性與對照組基本一致。

圖6 亞甲基藍脅迫對羅氏沼蝦肝胰腺AKP和ACP活性的影響Fig.6 Effect of MB stress on AKP and ACP activities in the hepatopancreas of M.rosenbergii

除免疫因子外，亞甲基藍暴露也導致羅氏沼蝦肝胰腺免疫相關基因表達水平的變化(圖7)。HSP基因在亞甲基藍暴露后表達水平顯著升高，其他三個免疫相關基因表達則出現顯著下降。proPO和TLR基因在亞甲基藍暴露2 d后表達水平顯著下降，低表達水平持續至暴露后第4 d，清水恢復3 d后proPO和TLR基因表達水平恢復至對照組水平。LEC基因在亞甲基藍暴露2 d后出現顯著下降，暴露后4 d下降至最低點，清水恢復3 d后LEC基因表達水平仍低于對照組，直至清水恢復7 d后LEC基因表達水平高于對照組，但差異不顯著。

圖7 亞甲基藍暴露對羅氏沼蝦肝胰腺組織HSP、proPO、TLR和LEC基因表達的影響Fig.7 Effects of MB on the expression of HSP,proPO,TLR,LEC in hepatopancreas tissues of M.rosenbergii

3 討論

3.1 亞甲基藍對羅氏沼蝦的毒性效應

據報道亞甲基藍對金魚苗(CarassiusauratusLinnaeus)[12]、三角魴夏花魚種(Megalobramaterminalis)[13]、高體鳑魚苗(Rhodeusocellatus)[14]，長薄鰍幼魚(LeptobotiaelongateBleeker)[15]的SC分別為2.36、1.24、0.96和0.93 mg/L。本研究發現，亞甲基藍對羅氏沼蝦的SC為1.1 mg/L，而在劉建勇等[4]的研究中亞甲基藍對凡納濱對蝦蚤狀幼體、糠蝦幼體及仔蝦的SC分別為0.025、0.029和0.073 mg/L，推測水產動物對亞甲基藍的敏感性與物種及個體大小有關。此外，我們發現，羅氏沼蝦對亞甲基藍暴露初期敏感度較低，24 h LC50達到209.7 mg/L，但亞甲基藍對羅氏沼蝦的毒性效應隨時間的延長逐漸加重，96 h LC50僅為2.8 mg/L。本實驗采用濃度為1.4 mg/L亞甲基藍暴露4 d，結果顯示亞甲基藍對羅氏沼蝦造成不可逆的病理損傷和功能障礙，如肝胰腺細胞轉運泡減少，肝胰腺小管變性，鰓絲基部出現大量空泡，鰓絲頂部出現腫大，腸道絨毛消失，柱狀細胞缺失等病理損傷，并且在去除亞甲基藍清水養殖7 d后部分損傷仍不可逆。因此建議養殖過程中采用短期浸泡方式進行殺菌消毒，應避免亞甲基藍的長期使用。

3.2 亞甲基藍對羅氏沼蝦抗氧化防御系統的影響

在病原體入侵時，機體通過氧化應激產生大量的活性氧(ROS)，而抗氧化系統可以清除機體內過量ROS，避免機體受到氧化損傷，當抗氧化系統失衡，機體內產生造成細胞損傷的氧自由基(H2O2)和脂質過氧化產物(MDA)[16]。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是水生動物機體抗氧化酶系統中的重要組成部分，是調節機體內氧化平衡的第一道防線[17]。SOD催化超氧化物歧化成H2O2，GSH-Px將H2O2還原成H2O和O2，阻止脂質過氧化反應，減緩氧化應激損傷[18]。本研究中，亞甲基藍暴露導致SOD和GSH-Px活性顯著降低，表明亞甲基藍抑制抗氧化酶的活性。此外，本研究中H2O2和MDA含量在羅氏沼蝦肝胰腺組織中顯著上升，二者的積累表明羅氏沼蝦體內產生大量氧自由基，并導致過氧化現象，標志著機體出現嚴重的氧化應激損傷[19]。暴露后的羅氏沼蝦轉移至清水養殖7 d后，上述指標均恢復至對照組水平，推測亞甲基藍對羅氏沼蝦抗氧化系統的損傷具有可逆性。

3.3 亞甲基藍對羅氏沼蝦免疫系統的影響

甲殼動物缺乏特異性免疫力，依靠非特異性免疫系統抵抗病原干擾，如細胞和體液免疫應答[20]。酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)是非特異性磷酸單酯水解酶，通過直接溶解或消化外源物質以達到防御的目的，反映了機體對外源性物質的防御力[21]，是評價甲殼動物免疫狀態的重要指標[22]。AKP和ACP極易受外界環境影響，pH、溫度、重金屬、病原體等因素[23,24]均可導致其活性發生改變，本研究發現，亞甲基藍暴露導致肝胰腺出現嚴重組織病理損傷，并顯著降低羅氏沼蝦AKP和ACP活性，相似的結果在敵百蟲對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的毒性研究中也有報道[25]。除AKP和ACP外，熱應激蛋白(heat shock proteins,HSP)，酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、Toll樣受體(toll-likereceptor,TLRs)和凝集素(lectin,LEC)也是甲殼類動物重要的先天免疫因子。HSP又稱熱休克蛋白，是生物體內參與抗逆功能的重要蛋白，外界刺激(如高溫、缺氧、病毒感染、自由基等)均可誘導熱休克蛋白大量合成[26]。亞甲基藍暴露后，羅氏沼蝦HSP基因表達顯著上調，表明亞甲基藍可誘導羅氏沼蝦合成熱休克蛋白，增強對外界環境的抵抗力。proPO是酚氧化酶(PO)的前體物質，機體受到病原刺激后可觸發酚氧化酶原激活系統，將proPO裂解為PO通過胞吐釋放進入血淋巴，在病原體周圍形成黑色素沉淀消滅病原[27]。TLRs是一種特殊結構模式識別受體，可廣泛性識別病原微生物進化存在的保守分子[28]。LEC作為免疫效應分子凝集素，具有識別、黏附，調理，促吞噬等生理生化功能[29]。本研究中亞甲基藍脅迫暴露導致proPO、TLR和LEC基因表達量顯著下降，AKP和ACP活性降低，推測亞甲基藍暴露可對羅氏沼蝦免疫系統造成嚴重損害，清水養殖7 d后，上述免疫基因表達水平和酶活均恢復至對照組水平，推測1.4 mg/L濃度亞甲基藍對羅氏沼蝦非特異性免疫因子的損傷可逆。

4 結論

羅氏沼蝦對亞甲基藍較為敏感，1.4 mg/L濃度亞甲基藍的持續暴露可導致羅氏沼蝦肝胰腺、腸道和鰓組織的病理損傷，并破壞抗氧化系統和免疫系統，去除亞甲基藍并于清水中恢復7 d后，大部分損傷可恢復，然仍有部分組織病理損傷不可逆。