赤芍治療銀屑病的網絡藥理學機制

沈樹青，賈 敏，胡文韜，狄 偉

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

銀屑病是一種遺傳與環境共同作用誘發的免疫介導的慢性、復發性、炎癥性、系統性疾病，其典型臨床表現為鱗屑性紅斑或斑塊，局限或廣泛分布[1-2]，治療困難，常終身患病。銀屑病分為尋常型、紅皮病型、膿皰型和關節病型，以尋常型最為常見[3]，約占病例的90%以上[4]，治療以生物制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑、維A酸類為主，不良反應較多。

銀屑病中醫稱為“白疕”[5]，辨證論治規律為“辨血為主、從血論治”[6]，基本證型分為血熱證、血燥證和血瘀證，治療以清熱涼血解毒、養血潤燥為主[3]。赤芍來自毛茛科植物，根部入藥，具有清熱涼血、散瘀止痛等功效，藥理活性包括保肝、抗炎、抗腫瘤、保護心血管和神經等[7]。與西醫藥治療比較，恰當地使用中醫藥具有增效減毒的優勢。本研究運用網絡藥理學方法從“中藥-成分-靶點-疾病”的思路對赤芍的有效成分、潛在靶點、生物學功能、蛋白互作、信號通路進行了可視化展示，初步分析了赤芍治療銀屑病的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 將TCMSP數據庫獲得的赤芍有效成分和作用靶點，以及通過DisGeNET數據庫獲得的銀屑病相關基因作為研究對象，取交集后得到赤芍和銀屑病的核心基因。

1.2方法

1.2.1中藥有效活性成分及作用靶點篩選 運用TCMSP數據庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索“赤芍”，設置篩選標準口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18得到赤芍的有效成分及作用靶點，繼而利用Perl軟件(V5.36.0)和UniProt知識庫(https：//www.uniprot.org/)篩選出靶點。

1.2.2疾病靶點預測 在DisGeNET數據庫(https：//www.disgenet.org/)中搜索關鍵詞“psoriasis”，獲得相關靶點。

1.2.3中藥-疾病共同靶點篩選 利用Vinny(2.1.0)(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將赤芍成分靶點和銀屑病相關靶點通過線韋恩圖進行一一映射，獲得赤芍和銀屑病的共同靶點交集圖。

1.2.4中藥-成分-靶點-疾病網絡構建 運用Perl軟件進行處理赤芍-銀屑病靶點，利用Cytoscape(3.9.1)軟件構建赤芍-成分-靶點-銀屑病繪制網絡圖。

1.2.5中藥-疾病靶點蛋白質互作網絡(PPI)構建 將赤芍成分靶點和銀屑病相關的靶點導入STRING數據庫(https：//cn.string-db.org/cgi/)構建PPI圖，篩選種屬選擇“Homo sapiens”，設置最小互作分數值為0.4，并通過R語言計算各節點的度值得到柱形圖進行可視化分析。

1.2.6基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用Bioconductor平臺(http：//bioconductor.org/biocLite.R)和R語言ggplot2包對獲得的基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將結果導入微生信在線作圖平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化呈現。

2 結 果

2.1赤芍的有效成分及靶點 赤芍的有效活性成分共119個，初篩得到29個，有效成分對應的靶點41個。見表1。

表1 赤芍的有效活性成分

續表1 赤芍的有效活性成分

2.2疾病靶點篩選及赤芍-銀屑病共同靶點預測 獲取與銀屑病相關靶點1 287個，赤芍與銀屑病共同靶點21個，包括ESR1、PGR、RELA、VEGFA、NFKBIA、GSTP1、IGF2、GSTM1、GSTM2、白細胞介素-6(IL-6)、PTGS1、BCL2、FOS、CASP3、TP63、HIF1A、FOSL1、CCNB1、AHR、PON1和PLAU，均為赤芍治療銀屑病的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 赤芍有效成分靶點-疾病靶點韋恩圖

2.3中藥-成分-疾病-靶點網絡圖 赤芍主要依靠11種活性成分通過21個靶點治療銀屑病，如β-谷甾醇、芍藥苷、谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、黃芩素、菠菜甾醇、(2R，3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、豆甾-7-烯醇、兒茶素(+)、菜油甾醇等。

2.4PPI 赤芍治療銀屑病的潛在靶點PPI圖由21個節點和172條邊組成。見圖2。中藥-疾病核心靶點前10位按鄰接節點數目由多至少依次為ESR1、HIF1A、IL-6、PGR、VEGFA、FOS、RELA、CASP3、NFKBIA和AHR等。ESR1的鄰接節點均為30個靶蛋白基因，HIF1A、IL-6的鄰接節點均為28個靶蛋白基因，PGR、VEGFA的鄰接節點均為26個靶蛋白基因，FOS、RELA的鄰接節點均為24個靶蛋白基因，是該網絡的重要節點，表明其可能是赤芍治療銀屑病的關鍵基因。見圖3。

圖2 中藥-疾病靶點PPI圖

圖3 核心靶點排序

2.5GO功能富集分析 286個生物學過程主要涉及抗氧化反應、對無機物的應答、對氧化應激的反應等；5個細胞組成涉及轉錄調控復合物、RNA聚合酶Ⅰ轉錄調控復合物、分泌顆粒管腔等；35個分子功能涉及轉錄激活因子結合、轉錄共調節因子結合、轉錄因子結合等。見圖4。

2.6KEGG通路富集分析 包括77條通路，共同靶點主要富集于癌癥通路、化學致癌-受體激活、化學致癌-活性氧、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、輔助性T淋巴細胞17(Th17)細胞分化、沙門氏桿菌傳染病、麻疹、脂質與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路等。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

3 討 論

網絡藥理學研究發現，赤芍含有的β-谷甾醇、菠菜甾醇、黃芩素、鞣花酸、豆甾醇等活性成分可能為治療銀屑病的關鍵。5種成分均具有抗炎功效，鞣花酸通過降低脂多糖引起的血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β水平[8]，可抑制被認為是銀屑病致病主要驅動力的TNF-α[9]，從而抑制炎癥的發生。黃芩素通過降低TNF-α水平而調節炎性反應。王昭等[10]發現，經黃芩素干預后膿毒癥大鼠血清升高的TNF-α、IL-6水平均有所下降，降低的T淋巴細胞亞族百分比、Th1/Th2值均有所升高，表明黃芩素可下調膿毒癥大鼠炎性細胞因子水平、改善免疫功能。有研究表明，β-谷甾醇可通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族熱蛋白結構域3的激活而抑制CAS1的產生及絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活化，導致細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成顯著減少，從而起到抗炎作用[11]。菠菜甾醇是一種安全的抗炎藥，其抗炎機制包括抑制環氧合酶、拮抗瞬時受體電位通道香草酸亞型-1受體和減弱促炎性細胞因子和介質[12]。ANTWI等[13]發現，豆甾醇除能減輕免疫球蛋白E介導動物的皮膚過敏反應、減小反應面積外，還能減少動物抓撓行為，顯著減少皮膚組織的表皮層增厚和炎癥細胞浸潤，表明豆甾醇在治療皮膚過敏性疾病方面具有一定潛力。

本研究通過構建的PPI圖及條形圖顯示，排列前5的靶蛋白包括ESR1、HIF1A、IL-6、PGR和VEGFA。ESR1是雌激素受體α的編碼基因，其轉錄調控對雌激素信號通路下游效應的調控至關重要[14]。OLFM作為一種瞬時上調的炎癥信號，ESR1是OLFM4誘導角質形成細胞信號傳導的中樞，通過調節皮膚的真皮和表皮細胞而促進傷口愈合[15]。TANG等[16]研究表明，尋常型銀屑病的病灶中HIF1A高表達。CD4+T淋巴細胞的過度激活和Th17/Th1分化是銀屑病發病機制中的關鍵，促炎性細胞因子IL-23誘導CD4+T淋巴細胞中CDK7表達增加并激活蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白/ HIF1A信號通路，增強糖酵解代謝。相應地，CDK7抑制通過蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白/ HIF1A途徑顯著損害了IL-23誘導的糖酵解，從而激活T淋巴細胞和Th17/Th1分化，促進銀屑病的發病[17]。IL-6是Th1的重要組成成分，是一種多效性細胞因子，具有促炎和抗炎雙重作用，參與了調節免疫反應、血細胞生成、上皮細胞及免疫細胞增殖和分化等。當IL-6表達失常時，其參與炎癥免疫反應，導致自身免疫性疾病的發生。有研究證明，IL-6是銀屑病細胞因子網絡中的關鍵成分，參與了銀屑病的發病，并且與浸潤的細胞成分和皮膚基底角質形成細胞的增殖有關[18]。BENHADOU等[19]研究表明，角質形成細胞、免疫細胞和內皮細胞上VEGFA介導的銀屑病表型大多數是角質形成細胞中VEGFA信號以FLT1/NRP1依賴的方式傳遞的結果。

赤芍治療銀屑病的GO功能富集分析主要涉及抗氧化反應、對無機物的應答、對氧化應激的反應等生物學過程；涉及轉錄調控復合物、RNA聚合酶Ⅰ轉錄調控復合物、分泌顆粒管腔等細胞組成；涉及轉錄激活因子結合、轉錄共調節因子結合、轉錄因子結合等分子功能。氧化應激是銀屑病病理生理學的另一個重要因素，在銀屑病中氧化還原失衡已經在皮膚細胞和系統中，以及在血漿和血細胞中[20]，從而加重皮損的發生。

赤芍治療銀屑病的KEGG通路富集分析效應機制主要與癌癥通路、化學致癌-受體激活、化學致癌-活性氧、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、Th1細胞分化、IL-17信號通路、沙門氏桿菌傳染病、麻疹、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化等有關。在多條癌癥通路中提示，銀屑病與腫瘤存在著細胞過度增殖的相似性，且抑制細胞的能量供應亦能有效減輕銀屑病皮膚增殖和炎性反應[21]。IL-17被認為是重要的免疫介質，不僅介導皮損的發展，而且介導銀屑病相關共病的發生[20]。在與心血管疾病相關的流體剪切應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化通路方面的證據表明，IL-17可能是心血管疾病和銀屑病炎癥之間的聯系之一[22]。

本研究結果顯示，赤芍有效成分包括鞣花酸、黃芩素、β-谷甾醇、菠菜甾醇和豆甾醇等，協同作用于與疾病相關的ESR1、HIF1A、IL-6、PGR、VEGFA等靶蛋白，調節癌癥通路、化學致癌-受體激活、化學致癌-活性氧、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、Th1細胞分化、IL-17信號通路、沙門氏桿菌傳染病、麻疹、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化通路等來緩解抗氧化反應、對無機物的應答、對氧化應激的反應，調節激活因子結合及轉錄共調節因子等方式而發揮其治療作用，充分發揮了中藥多成分、多靶點、多通路治療疾病的特點，初步分析了赤芍主要通過抗氧化反應和調控細胞炎性反應來發揮治療銀屑病的作用，為后續研究提供了理論參考依據。