丹酚酸A聯用氧化槐定堿抑制宮頸上皮內瘤變細胞的作用機制*

冷雪嬌，闞宏飛，吳沁航，李存玉，鄭云楓，彭國平

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，是威脅女性健康的主要疾病之一[1]。造成宮頸癌的因素多種多樣，但最為主要的原因是人乳頭瘤病毒(HPV)感染，從HPV感染發展為宮頸癌需要幾年至數十年時間，在此過程中會發生宮頸上皮內瘤變(CIN)，相當于 “癌前”階段[2-3]，此階段是預防宮頸癌發生的重要窗口期。目前，對CIN1患者的治療方法是定期檢查和隨訪，對CIN2、CIN3患者的治療方法是采用冷刀錐切術或環形電切術。然而，手術治療會對人體造成永久性損傷[4-5]，導致長期生殖系統疾病[6]。藥物治療CIN可避免手術治療引起的不良反應，防止宮頸癌的發生。因此，研究治療CIN的藥物具有十分重要的意義。

丹參具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和腦血管保護作用[7-8]。丹酚酸是丹參中最重要的生物活性成分之一。丹酚酸A(SAA)是丹參的親水性成分之一，具有多種藥理活性，包括抗炎[9]、抗氧化[10]、心臟保護[11]、抗病毒和抗腫瘤(包括抑制宮頸癌細胞)作用[12-14]。氧化槐定堿(OSR)是從苦豆子中提取的生物堿，已被證明對缺血性腦損傷具有保護作用[15]。此外，OSR還具有多種藥理活性，包括抗炎[16]、抗氧化應激[17]、抗病毒和抗腫瘤作用[18-19]。

有研究發現，SAA、OSR聯合用藥可協同抑制CIN細胞(H8細胞)，其最佳聯合用藥比為1∶2，聯合用藥指數(CI)值為0.59，SAA、OSR對H8細胞的半數抑制濃度分別為(1.87±0.37)μmol/L和(3.73±0.74)μmol/L[20]。本研究選擇2 μmol/L SAA、4 μmol/L OSR、2 μmol/L SAA 聯合 4 μmol/L OSR處理H8細胞，通過Hochest33342染色實驗、細胞周期測定、蛋白免疫印跡法實驗研究了SAA、OSR聯合用藥對H8細胞的協同作用機制，以期為SAA、OSR聯合治療宮頸癌前病變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 SAA(批號Z23D10X106625)、OSR(批號 Y06S10W97027)均購自上海源葉生物科技有限公司，H8細胞由中國科學院協和醫科大學基礎醫學研究所提供，RPMI-1640培養基(批號 8121105)購自HyClone中國公司，胎牛血清(批號42G9285K)、0.25%乙二胺四乙酸胰酶(批號2186974)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號8121037)、雙抗(批號2199843)均購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(批號RNBJ6688)購自美國Sigma公司，Hochest33342(批號40731ES10)購自上海翊圣生物科技有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法凝膠制備試劑盒(批號AR0138)、電泳緩沖液(批號AR1146)、轉膜緩沖液(批號AR1151)、RIPA 裂解液(批號 AR0105)、蛋白酶抑制劑(批號AR1182)、BCA蛋白定量試劑盒(批號AR0146)、蛋白上樣緩沖液(批號AR1112)、彩色預染蛋白Marker (批號AR1113)、洗滌緩沖液TBST (批號AR0195-10)、電化學發光試劑(ECL,批號AR1196)均購自武漢博士德生物工程有限公司，細胞周期蛋白B1(CyclinB1)抗體(批號A00745-1)、細胞周期蛋白依賴性激酶-1(CDK1)抗體(批號BA0027-2)、B細胞淋巴相關X蛋白(Bax)抗體(批號A00183)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)抗體(批號A00040-2)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體(批號BM3937)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(批號BM0627)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2儀器 HERAcell 150i型細胞培養孵箱購自美國Thermo公司，TS2-S-SM型倒置生物顯微鏡購自尼康(Nikon)中國有限公司，LDZ5型臺式離心機購自北京雷勃爾離心機有限公司，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，DYY-6C型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，灌膠、垂直電泳、轉印裝置、Tanon5200型全自動化學發光成像分析系統均購自上海天能科技有限公司，DMI3000B型倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡(Leica)公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 H8細胞培養于含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養液中，置于37 ℃、5%二氧化碳細胞培養箱中培養。

1.2.2細胞形態觀察 將H8細胞制成單細胞懸液，按2×105個/mL接種于6孔板，每孔1 mL，置于37 ℃、5% 二氧化碳培養箱中培養24 h，給藥處理后直接放于倒置顯微鏡下觀察H8細胞形態及生長情況并拍照。

1.2.3Hochest33342染色法觀察細胞凋亡 H8細胞用胰蛋白酶消化后離心收集細胞，計數，以2×105個/孔接入6孔板中孵育 24 h后換液。SAA、OSR及其聯合用藥3個處理組和對照組分別繼續培養24 h，經處理后棄培養基，用無菌的PBS清洗2～3次。每孔添加1 mL Hochest33342染液，避光孵育20～30 min，用無菌的PBS清洗2～3次，熒光顯微鏡觀察細胞形態和染色情況，并拍照。Hochest33342能穿透細胞膜進入正常細胞和凋亡細胞，并能與細胞DNA結合。Hochest33342與細胞DNA結合染色后活細胞呈深藍色，正常凋亡細胞呈亮藍色[21-22]。

1.2.4細胞周期測定 以4×105個/孔接種于6孔板，對照組和3個處理組細胞黏附后用藥物處理24 h。胰蛋白酶消化后收集細胞，1 000 r/min離心5 min后用4 ℃預冷PBS清洗，吸盡上清液后用75%預冷乙醇與細胞混合，斡旋振蕩后置于4 ℃下冰箱固定過夜，1 000 r/min離心5 min后用預冷PBS清洗，離心，棄上清液，向細胞懸浮液中加入0.5 mL含有RNA酶A的碘化丙啶染色液。所有樣品在37 ℃下避光孵育30 min，使用流式細胞儀進行分析。使用Kaluza Analysis軟件對數據進行分析。細胞周期分為有絲分裂期(M期)和細胞間期，細胞間期又分為休眠期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)，整個細胞周期可表示為G1期→S期→G2期→M期[23-24]。細胞DNA周期檢測可測定細胞各時期狀況，進而反映細胞增殖情況[25]。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達 以4×105個/孔接種于6孔板，對照組和3個處理組細胞黏附后用藥物處理24 h。胰蛋白酶消化后收集細胞提取蛋白質，用BCA試劑盒測定蛋白質濃度，蛋白樣品用5%分離膠，12%濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳，然后轉移至硝酸纖維素膜(0.22 μm)上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，含吐溫-20的PBS(PBST)洗膜后加入二抗，室溫孵育1.5 h，再用PBST洗膜3次，每次15 min，ECL工作液于印跡膜上30～60 s，吸干發光液，置印跡膜于成像分析儀自動成像，應用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值及蛋白條帶，以β-actin為內參。

2 結 果

2.1各組H8細胞形態比較 與對照組比較，各處理組H8細胞形態均變小、變圓，且黏附力均下降。聯合用藥組H8細胞24 h后細胞形態更小、更圓，且黏附力更差，細胞幾乎快脫落。SAA、OSR聯合用藥對H8細胞形態改變具有協同增效作用。見圖1。

圖1 各組H8細胞形態比較(顯微鏡，200×)

2.2各組H8細胞凋亡情況比較 與對照組比較，處理組H8細胞亮藍色細胞數量均明顯增加，聯合用藥組H8細胞亮藍色細胞數量明顯高于SAA組和OSR組，說明SAA、OSR聯合用藥可協同促進H8細胞凋亡。見圖2。

圖2 各組H8細胞凋亡情況比較(Hochest33342染色法，100×)

2.3各組H8細胞周期比較 與對照組比較，OSR組、聯合用藥組H8細胞處理24 h后G2期細胞數量明顯增加，G1期細胞數量明顯減少，表示H8細胞被阻滯在G2/M期。SAA對H8細胞周期調控無明顯影響，但可協同OSR調控H8細胞周期。聯合用藥組H8細胞G2期細胞增加和G1期細胞減少較SAA組和OSR組更為顯著，表明SAA、OSR可協同調控H8細胞周期，將H8細胞阻滯在G2/M期。見圖3。

注：A.各組H8細胞周期圖；B. 各組H8細胞各周期的細胞數量占比比較；與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與聯合用藥組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4各組H8細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較 與對照組比較，SAA、OSR均可下調H8細胞中Bcl-2蛋白表達，上調Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達。SAA、OSR聯合用藥導致Bcl-2蛋白表達明顯降低，與SAA組、OSR組比較，分別降低27%和49%。表明SAA、OSR聯合用藥可抑制Bcl-2蛋白表達，促進Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達，進而促進H8細胞凋亡。見圖4。

注：A.各組H8細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達蛋白免疫印跡法實驗結果；B. 各組H8細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較；與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001；與聯合用藥組比較，dP<0.05。

3 討 論

造成CIN和宮頸癌發生的因素多種多樣，但最為主要的發病原因為HPV感染[2-3]。HPV被大量復制擴散后部分HPV-DNA整合入宿主染色體內，誘發基因突變，激活病毒癌基因，造成癌蛋白過度表達，干擾正常細胞周期，抑制細胞凋亡，破壞機體免疫，使病毒長期持續感染，發生宮頸上皮細胞不典型增生，產生CIN，繼續發展則造成宮頸癌變[26]。及時治療CIN能預防宮頸癌的發生，然而，目前治療CIN的主要方法依然為手術治療，有學者開展的治療CIN藥物的研究發現，SAA、OSR可抑制H8細胞，且二者對其具有協同增效的抑制作用[20]。為探索SAA、OSR聯合用藥的作用機制，本研究對SAA、OSR及其聯合用藥開展了研究，結果顯示，SAA、OSR聯合用藥可通過調節H8細胞周期，將H8細胞阻滯在G2/M期，阻止細胞進入有絲分裂，抑制細胞增殖，且SAA、OSR聯合用藥對H8細胞周期的調節作用明顯優于單一藥物，表明SAA、OSR聯合用藥對H8細胞周期具有協同調節作用。

SAA、OSR可協同促進H8細胞凋亡，但其共同促進細胞凋亡的原因尚不清楚。線粒體是細胞凋亡發生的主要場所，線粒體能通過釋放各種刺激信號調節 Bcl-2 蛋白(抗凋亡蛋白)促使 Bax 蛋白(促凋亡蛋白)表達誘導細胞凋亡[27]。Caspase-3是Caspase蛋白家族成員之一，可激活凋亡信號的傳遞，是促進細胞凋亡的關鍵蛋白[27-28]?；罨蟮腃aspase-3(Cleaved Caspase-3)能破壞細胞正常功能，從而促進細胞凋亡[29]。本研究結果顯示，SAA、OSR均能通過下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達，進而促進H8細胞凋亡，與單獨用藥比較，SAA、OSR聯合用藥對H8細胞Bcl-2蛋白表達的抑制作用更為顯著。因此，SAA、OSR聯合用藥可通過線粒體途徑協同促進H8細胞凋亡。

綜上所述，SAA、OSR聯合用藥可通過協同調節H8細胞周期，將細胞阻滯在G2/M期，抑制H8細胞增殖，通過下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達促進H8細胞凋亡。