新疆地區絕經后T2DM患者LRP6基因位點多態性及突變與骨密度的相關性*

王婭寧，李 軍，李思源，邵 晗，王 雙，石艷秋，李佳佳

(1.新疆石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科，新疆 石河子 832000；3.上海市楊浦區中心醫院，上海 200082；4.浙江蕭山醫院，浙江 杭州 310000；5.南陽市第二人民醫院，河南 南陽 473000)

糖尿病是一種遺傳和環境共同作用導致血糖升高的慢性代謝性疾病，其中2型糖尿病(T2DM)的發病是由多種基因共同參與的[1]。骨質疏松癥(OP)是一種以骨組織微結構受損、骨密度(BMD)下降為特征的代謝性疾病，常見于絕經后女性，OP是T2DM的常見并發癥[2]。Wnt信號通路是調節細胞生長、增殖的關鍵，與糖、脂、骨代謝密切相關[3]。低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)基因可通過激活Wnt通路[4]，參與T2DM[5]、OP[6]的發生和發展。ZENIBAYASHI等[7]在日本人群開展的一項研究發現，LRP6基因rs2417086、rs10743980位點突變與T2DM有關。目前，我國新疆地區T2DM患病率較高，而這些患者常合并OP，本研究對LRP6基因的研究不是第一個，但以往對LRP6基因多態性及突變的研究存在沖突，關于絕經后T2DM患者LRP6基因與BMD關系的研究較少見，并且國內很少有學者對LRP6基因在絕經后T2DM合并OP患者進行研究。因此，本研究測定了我國新疆地區絕經后T2DM患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位點多態性及突變情況，探討了我國新疆地區絕經后T2DM患者這類特殊人群中LRP6基因位點多態性及突變與BMD的關系，旨在預防T2DM合并OP的發生。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 選取2018年11月至2019年10月石河子大學醫學院第一附屬醫院門診、住院及社區收治的絕經后女性136例，根據不同血糖及BMD分為糖耐量正常伴骨量正常組(A組，26例)、T2DM伴骨量正常組(B組，27例)、糖耐量正常伴骨量異常組(C組，28例)和T2DM伴骨量異常組(D組，55例)。本研究獲石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會審批。

1.1.2納入標準 (1)自然絕經后女性，年齡50～80歲；(2)符合T2DM和OP 1999年世界衛生組織推薦的診斷標準[8-9]；(3)簽署本研究知情同意書。

1.1.3排除標準 (1)1型糖尿病；(2)自身免疫性疾病；(3)嚴重心、肝、腎臟疾病；(4)惡性腫瘤；(5)對鈣(Ca)及其他骨代謝指標有影響的基礎疾病。

1.2方法

1.2.1資料收集 包括患者年齡、絕經年限、體重指數(BMI)和腰臀比(WHR)等一般資料。

1.2.2實驗室檢測 采用高壓液相法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)，羅氏全自動生化分析儀(型號 Modular DPP-H7600)測定空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、Ca、磷(P)和堿性磷酸酶(ALP)。采用雙能X線吸收法測定腰椎(L)1～4、股骨頸BMD。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜方法測定LRP6基因rs10743980、rs2302685位點基因多態性及基因型分布頻率。

1.2.3Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢測 在A組中進行遺傳平衡檢驗。LRP6 基因rs10743980、rs2302685位點的基因型分布頻率與Hardy-Weinberg平衡相符，差異無統計學意義(P>0.05)。

2 結 果

2.1各組患者一般資料比較 與A組比較，D組患者年齡、絕經年限均更高，差異均有統計學意義(P<0.05)。B組患者年齡、絕經年限、WHR均高于A組，BMI低于A組；C組患者年齡、絕經年限高于A組，WHR、BMI低于A組，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組患者一般資料比較[M(P25,P75)]

2.2各組患者實驗室檢測指標比較 與A組比較，B、D組患者FPG、HbA1c均更高，C、D組患者TG，以及L1～4、股骨頸BMD均更低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組患者實驗室檢測指標比較[M(P25,P75)或

2.3各組患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位點基因型與等位基因分布頻率比較 各組患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位點基因型和基因頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。因LRP6 基因rs10743980位點TT基因型和rs2302685位點CC基因型患者數較少，故將CT與TT合并，CT與CC合并，納入突變型組。

表3 各組患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位點基因型與等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.4各組患者中LRP6基因rs10743980位點野生型(CC基因型)與突變型(CT/TT基因型)者實驗室檢測指標比較 A、B、C組患者中LRP6基因rs10743980位點CC基因型與CT/TT基因型者實驗室檢測指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。D組患者中CC基因型者HbA1c明顯低于CT/TT基因型，TG、股骨頸BMD均明顯高于CT/TT基因型，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 D組患者中LRP6基因rs10743980位點CC基因型與CT/TT基因型者實驗室檢測指標比較

2.5各組患者中LRP6基因rs2302685位點野生型(TT基因型)與突變型(TC/CC基因型)者實驗室檢測指標比較 A、B、C組患者中LRP6基因rs2302685位點TT基因型與TC/CC基因型者實驗室檢測指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。D組患者中TT基因型者HDL-C明顯低于TC/CC基因型者，TG、Ca、L1～4BMD均明顯高于TC/CC 基因型，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 D組患者中LRP6基因rs2302685位點TT基因型與TC/CC基因型者實驗室檢測指標比較

2.6LRP6基因rs10743980、rs2302685位點野生型和突變型患者BMD比較 與CC×TT患者比較，CT/TT×TT患者L1～4BMD更低[分別為(1.01±0.12)、(0.93±0.11)g/m2]，CC×CT/CC患者股骨頸BMD更低[分別為(0.79±0.13)、(0.73±0.09)g/m2]，CT/TT×CT/CC患者L1～4、股骨頸BMD降低更明顯[分別為(1.01±0.12)、(0.83±0.14)g/m2，(0.79±0.13)、(0.71±0.15)g/m2]。說明在同一基因中當存在兩位點同時突變時會造成更低的BMD。見圖1。

注：A. L1～4 BMD ；B. 股骨頸BMD。CC×TT為rs10743980位點CC基因型合并rs2302685位點TT基因型；CT/TT×TT為rs10743980位點CT/TT基因型合并rs2302685位點TT基因型；CC×CT/CC為rs10743980位點CC基因型合并rs2302685位點CT/CC基因型；CT/TT×CT/CC為rs10743980位點CT/TT基因型合并rs2302685位點CT/CC基因型。

2.7多元線性回歸模型分析 HDL-C升高、BMI降低是股骨頸BMD降低的危險因素(P<0.05)；LRP6基因 rs10743980位點突變是L1～4BMD降低的危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 多元線性回歸模型分析

3 討 論

OP是中老年人常見病，而T2DM患者更易合并OP，OP常表現為BMD降低，OP患者骨折風險大大增加，為人們生活帶來了沉重的經濟負擔[10]。OP受多種因素，如年齡、絕經年限、激素水平等影響。有研究表明，隨年齡增長，成年女性骨皮質孔隙分別增加176%和259%[11]。年齡增長與骨細胞數量減少密切相關[12-13]。另外，隨年齡增加而出現的骨細胞死亡增多與多種因素相關，包括雌激素缺乏、脂質過氧化、內源性糖皮質激素過量等。雌激素缺乏人群骨細胞凋亡增加，進而導致骨量減少[14-16]，證明了雌激素缺乏對骨重塑平衡具有不良影響。由于女性圍絕經期卵巢功能衰退，年齡增長與雌激素缺乏時期重疊，兩因素間可能存在協同作用[17]。馬崢[18]研究表明，絕經后女性OP患病率為53.3%，明顯高于全國平均水平(23.7%)。多項研究均證實，雌激素對BMD具有保護作用。ABDI等[19]研究結果顯示，對絕經后女性經皮雌激素給藥治療后，1年和2年后腰椎BMD分別比基線值增高3.4%和3.7%。本研究結果顯示，隨年齡及絕經年限的增長，OP患病率也增加。

LRP6是組成Wnt信號通路的跨膜受體蛋白，其基因突變會導致Wnt信號通路失去對細胞的調控作用。同時，Wnt信號通路與T2DM[20]、OP[21]、血脂代謝[22]等多種疾病相關，但目前LRP6基因在我國新疆地區絕經后T2DM合并OP患者中尚鮮見報道。 RIANCHO等[23]在絕經后女性中的研究結果顯示，LRP6基因rs2302685、rs11054704位點多態性與BMD相關。同樣，本研究也對我國新疆地區絕經后T2DM患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位點進行了研究，結果顯示，基因多態性和基因頻率均與BMD無關。本研究結果與上述研究不相同的原因可能是，上述研究結果大多數來自歐洲及北美人群，不同基因在不同人群中表達不一致，樣本量的大小及納入人群的標準也不完全相同。

在基因突變與BMD研究方面，LI等[24]在對Wnt信號通路的研究中也證實絕經后女性BMD水平降低與LRP6基因突變有關。STüRZNICKEL等[25]同樣證實在骨代謝和骨折中LRP5、LRP6基因共同發揮作用。本研究結果顯示，A、B、C組患者中LRP6基因rs10743980、rs2302685位點野生型與突變型者各實驗室檢測指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，造成這種結果可能的原因是OP的發病機制相對復雜，而D組患者年齡、絕經年限均高于A、B、C組，疾病的發生多是由基因-環境相互作用引起的，在LRP6基因單核苷酸多態性位點突變的前提下，多個環境因素相互疊加更易導致代謝異常。而D組患者中LRP6基因 rs10743980位點股骨頸BMD野生型高于突變型且該位點突變是L1～4BMD降低的危險因素，LRP6基因rs2302685位點Ca、L1～4BMD野生型高于突變型，提示LRP6基因兩位點突變均參與了BMD的降低。故本研究又針對基因突變對納入的我國新疆地區絕經女性進行了人群分類，結果顯示，基因突變人群BMD低于未發生基因突變者，當兩基因同時突變時BMD降低更明顯。表明上述位點突變型患者BMD低于野生型，其中可能是由于LRP6位點突變影響了成骨細胞的分化，導致Wnt3a信號傳導關鍵介質LRP6的缺失，從而引起骨代謝異常[26]。

BMI降低是股骨頸BMD降低的危險因素，BMI在一定范圍內增加時患者骨骼抗機械應力的能力增強，刺激成骨細胞的分裂[27]；HDL-C升高是股骨頸BMD降低的危險因素。有研究發現，LRP6蛋白有助于清除體內LDL-C，而LRP6基因突變導致LDL-C清除障礙、HDL-C功能受損。但維生素D缺乏的絕經后女性血清HDL水平與BMD呈負相關[28]。因此，LRP6可能成為BMD的潛在調節因子。

既往研究發現，LRP6基因突變型者TG、LDL-C均高于野生型[29]，從而使LRP6基因突變體攜帶者患T2DM的風險增高。本研究結果顯示，D組患者LRP6基因rs10743980位點中HbA1c水平突變型均高于野生型，TG水平突變型低于野生型，LRP6基因rs2302685位點中HDL-C水平突變型高于野生型，TG水平突變型低于野生型，提示LRP6基因突變參與了糖、脂代謝紊亂，與上述研究結果不一致。原因可能是，LRP6是Wnt信號通路協同受體之一，在糖、脂代謝調節過程中常需要多個協同受體(LRP5、LRP6、硬化蛋白等)共同作用調節下游分子的表達，調控生理機制，從而影響物質代謝[30]。因此，應在不同人群、不同地區進行進一步研究，單一基因突變可能被其他因素覆蓋。

本研究局限性：樣本量相對較小，應在較大樣本量中證實這種關系；應包括更多的LRP6基因單核苷酸多態性位點；影響BMD下降的機制錯綜復雜，在今后的研究中應關注基因-環境相互作用對BMD的影響。

綜上所述，我國新疆地區絕經后女性LRP6基因rs10743980、rs2302685位點多態性與BMD可能無關，但絕經后T2DM合并OP患者rs10743980、rs2302685位點突變參與了BMD的降低，從而在基因水平上為絕經后女性患T2DM合并OP的發生提供了理論依據。因此，對絕經后T2DM患者應注意篩查，提早干預，預防OP的發生。