化瘀通絡灸對血管性癡呆大鼠髓鞘再生相關蛋白表達的影響

王維順，楊 駿，樊吟秋，王 萍，查必祥，孔 鈺，張雅婷

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性、出血性卒中等血管性腦損傷疾病所產生的認知障礙綜合征，其臨床表現以記憶、行為和認知功能缺損為主[1]。VD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的常見癡呆類型[2]，約占所有癡呆病例的15%～20%[3]。VD目前尚無有效的治療手段，而艾灸可改善VD認知障礙，促進腦內神經新生和VD后神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的增殖、遷移、分化[4]。研究[5]表明，VD的病理特征除灰質損傷外，還包括白質損傷和髓鞘缺失。但既往研究主要著眼于腦灰質及構成灰質主體的神經細胞，針灸對VD后腦白質功能的影響鮮有報道。實際上除了大腦灰質會發生缺血、低氧損傷外，大腦白質亦對缺血、低氧敏感，因此腦白質的脫髓鞘病變被認為是VD的發病機制之一[6]。

化瘀通絡灸是治療腦血管病的有效方法，前期的臨床研究和基礎實驗[7-8]均證實了化瘀通絡灸治療VD的療效。本實驗觀察化瘀通絡灸對VD大鼠髓鞘再生相關蛋白表達的影響，探討化瘀通絡灸治療VD的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物 選用SPF級健康成年雄性Wistar大鼠60只，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可證號：SCXK(魯)2019-0003]提供，體質量(250±20)g。統一飼養于安徽中醫藥大學針灸經絡研究所普通級動物房。飼養條件：恒溫(25±1)℃，濕度(50±10)%。實驗獲得安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，倫理審批號：AHUCM-rats-2022034。

1.2 試劑 氯馬斯汀(批號 C129211)：阿拉丁；髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)一抗(批號 bs-0258R)、髓鞘相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein，MAG)一抗(批號 bs-0380R)：北京Bioss公司；Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)(批號 A0423)：上海碧云天生物技術有限公司；羊抗兔HRP標記二抗(批號 L3012)：美國SAB公司。

1.3 儀器 Morris水迷宮：北京眾實迪創科技發展有限公司；RM2016病理切片機：德國Leica；全自動數字掃描儀：匈牙利3DHISTECH公司；垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 模型復制與分組 將大鼠飼養1周后，使用Morris水迷宮實驗篩除原地旋轉、漂浮不動和特別靈敏的大鼠，將余下55只納入實驗。采用隨機數字表法將12只大鼠隨機選為假手術組，其余大鼠用于復制VD模型。采用雙側頸總動脈永久結扎法復制VD大鼠模型[9]。術前大鼠禁水、禁食8 h，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，淺反射消失后，將大鼠固定在特制鼠板上，無菌操作，在大鼠頸部正中作縱向切口，用鑷子鈍性分離一側頸總動脈，避免觸碰神經，動脈夾夾閉右側頸總動脈10 min，松開10 min，夾閉、松開反復操作3次，用4-0號外科縫線分別在動脈近心端及遠心端永久結扎，從中間剪斷動脈，縫合傷口，分開放回籠中飼養。1周后再以相同方法處理左側頸總動脈。假手術組按上述操作，分離頸總動脈后不作其他處理。模型復制3 d后，用水迷宮對大鼠進行模型鑒定。將假手術組大鼠定位航行實驗第4天逃避潛伏期的平均值作為參考值，再將模型復制后的每只大鼠第4天的平均逃避潛伏期減去參考值，所得差值與該鼠的平均逃避潛伏期相除得一比值，若比值超過20%，則表明模型復制成功[10]。篩選模型成功的VD大鼠36只，隨機分為艾灸組、西藥組、模型組，每組12只。

2.2 各組干預方法 艾灸組大鼠參照《實驗動物常用穴位名稱與定位》[11]選取“大椎”“百會”“神庭”穴進行艾灸，將大鼠固定于自制的灸架上，點燃清艾條(5 mm×12 cm，江蘇康美制藥有限公司)，于相應穴位上1～2 cm處進行懸灸，每天20 min，7 d為1個療程，共干預3個療程。西藥組大鼠用氯馬斯汀(H1受體拮抗劑)與蒸餾水配置灌胃溶液，按10 mL/kg灌胃，每日2次，7 d為1個療程，共干預3個療程。僅將假手術組和模型組大鼠放于灸架上，不作其他任何處理，干預時間同艾灸組。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 定位航行實驗 Morris水迷宮為大鼠通用型泳池，避光，控制水溫為(23±2)℃。沿水池周長等距分布，水池區域被劃分為4個象限，透明圓形平臺放在第3象限中間位置水下2 cm。將大鼠分別從4個象限放入水中，其逃避潛伏期為2 min內找到平臺的時間。2 min內仍未找到平臺的大鼠，將此次入水逃避潛伏期記錄為2 min，然后將大鼠引導到平臺上，停留30 s。連續訓練4 d，確保大鼠每天實驗時間相同，每次入水時位置相同。

2.3.2 免疫熒光染色法檢測大鼠胼胝體區MAG、MBP陽性細胞表達水平 治療結束24 h內，每組各取6只大鼠灌注4%多聚甲醛后取腦，將大腦組織用石蠟包埋后切片。切片使用0.01 mmol/L PBS漂洗，羊血清封閉，加入一抗MAG、MBP(1∶200)，4 ℃過夜，二抗使用Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500)，DAPI復染細胞核。陰性對照采用PBS代替一抗，其余步驟不變。用全自動數字掃描儀掃描整個腦片區域，重點觀察胼胝體區MAG、MBP的表達水平。

2.3.3 Western blot法檢測大鼠胼胝體區MAG、MBP表達水平 取剩余6只大鼠斷頭后取腦，冰上提取胼胝體，-80 ℃保存。裂解液提取組織總蛋白后，經上樣、電泳、轉膜等過程，分別加入一抗MBP(1∶1 000)、MAG(1∶1 000)，4 ℃孵育搖床過夜。加入羊抗兔HRP標記二抗(1∶5 000)，再使用ECL化學發光液顯影，放入成像系統中掃描，使用Image J軟件讀取灰度值。

3 結果

3.1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較 模型復制3 d后，用水迷宮對大鼠進行模型鑒定，假手術組大鼠(n=12)逃避潛伏期為(11.06±3.23)s，VD模型大鼠(n=36)逃避潛伏期為(66.58±31.76)s，兩組大鼠逃避潛伏期比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明VD大鼠模型制備成功。

與假手術組比較，干預后模型組逃避潛伏期延長(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組、西藥組逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05)。見圖1。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠胼胝體區MAG、MBP陽性細胞表達水平比較 胼胝體區MAG、MBP染色為絲狀。與假手術組比較，模型組胼胝體區MAG、MBP平均熒光強度均降低(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組MAG、MBP平均熒光強度增強(P<0.05)；與西藥組比較，艾灸組MAG平均熒光強度增強(P<0.05)，MBP平均熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：A.假手術組；B.模型組；C.艾灸組；D.西藥組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05

3.3 各組大鼠胼胝體區MAG、MBP表達水平比較 與假手術組比較，模型組胼胝體區MAG、MBP表達水平下降(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組MAG、MBP表達水平增加(P<0.05)；與西藥組比較，艾灸組MAG表達水平增加(P<0.05)，MBP表達水平組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A.假手術組；B.模型組；C.艾灸組；D.西藥組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05

4 討論

VD屬于中醫學“呆病”范疇，年老腎精不足，氣血虧虛，血脈瘀滯，腦絡瘀阻，日久可導致腦失所養、髓腦空虛，發為本病，故血瘀與VD密切相關。化瘀通絡灸取督脈百會、大椎、神庭穴，發揮艾灸溫陽通脈、活血散結的作用，以充養腦髓、安神寧志。研究[12]表明，針刺“百會”等督脈穴不僅可以改善學習記憶能力，而且能促進腦缺血大鼠腦白質髓鞘再生。本實驗通過Morris水迷宮觀察發現，艾灸干預后VD大鼠的逃避潛伏期比治療前顯著減少，說明化瘀通絡灸能改善VD大鼠學習記憶能力。這與課題組前期報道[13]的化瘀通絡灸能夠明顯改善VD大鼠學習記憶能力的研究結果一致。

腦白質由許多髓鞘化的軸突組成，其基礎代謝率高，因此即使是輕微缺血也會造成腦白質損傷。胼胝體是大腦最大的白質帶，是VD的主要損傷部位，故選用胼胝體作為VD白質損傷的觀察對象。髓鞘是白質中必不可少的成分，由成熟少突膠質細胞發出的細胞突起包裹神經細胞軸突形成。髓鞘的完整性對腦白質功能的恢復至關重要，因此髓鞘脫失也會引起以認知障礙為主的一系列臨床綜合征[14]。當提供營養支持時，腦白質中的髓鞘被激活，發生增殖，并遷移到損傷部位，使髓鞘重新包裹軸突，這個過程稱為“髓鞘再生”[15]。同時實驗研究[16]證明，氯馬斯汀(H1受體拮抗劑)具有增強少突膠質細胞分化和促進髓鞘再生的作用，因此本研究選擇氯馬斯汀作為陽性對照藥。

MAG是構成髓鞘的重要成分之一，其表達在髓鞘的最內層，直接與軸突表面相鄰，具有穩定軸-髓鞘方面的作用、維持髓鞘結構的完整性等[17]。有研究[18]報道，脫髓鞘會導致MAG損失，MAG可能是髓鞘形成所必需的物質。MBP位于髓鞘漿液表面，是髓鞘的特異性標志物，可啟動髓鞘的合成，穩定髓鞘的結構[19]。同時既往實驗[20]表明，大腦缺血損傷后，髓鞘相關蛋白MAG、MBP含量明顯降低。因此，髓鞘相關蛋白MAG、MBP表達水平的高低可反映髓鞘再生情況和中樞神經系統功能恢復程度。

本研究結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠髓鞘相關蛋白MAG、MBP表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組髓鞘相關蛋白MAG、MBP表達水平均顯著升高(P<0.05)。結果提示化瘀通絡灸能夠促進髓鞘相關蛋白MAG、MBP的合成，促進髓鞘再生。與西藥組比較，艾灸組MAG表達水平升高(P<0.05)，說明艾灸組的療效優于西藥組；艾灸組MBP表達趨勢略優于西藥組，但差異無統計學意義(P>0.05)，究其原因可能與樣本量不足有關。由此推斷，艾灸能夠加快大鼠腦白質髓鞘損傷的修復，從而證實化瘀通絡灸可以促進髓鞘再生，對促進髓鞘再生起到積極作用。

綜上，化瘀通絡灸能促進VD大鼠髓鞘相關蛋白MAG、MBP的合成，促使髓鞘再生，從而改善VD大鼠的學習記憶能力。