辛伐他汀對膿毒血癥大鼠肺損傷的保護作用

郭治華，張榮，王煜

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004）

膿毒血癥是一種由感染引起的生理、病理、生化異常的綜合征，可導(dǎo)致多器官功能障礙，是重癥監(jiān)護病房患者的主要死亡原因。肺是膿毒血癥時最易受損的靶器官，并且急性肺損傷（acute lung injury，ALI）發(fā)生的時間最早，發(fā)生率最高［1］。在膿毒癥誘導(dǎo)ALI進展過程中，炎癥和凋亡通路的異常活躍導(dǎo)致肺泡上皮細胞受損，上皮通透性增加，進而導(dǎo)致血管滲漏、炎癥滲出，并最終引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征［2］。研究［3］表明，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）除具有降脂作用外，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及改善血管內(nèi)皮細胞功能的作用。因此，本研究旨在探討辛伐他汀對膿毒血癥大鼠肺損傷的保護作用及其主要機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

將36只健康且不攜帶特異性病原體的成年雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量120 g±20 g，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪基地動物實驗中心）隨機分為假手術(shù)組、膿毒血癥組和治療組3組，每組12只。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 膿毒血癥動物模型構(gòu)建及處理

采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)大鼠膿毒血癥模型［4］。腹腔注射5%水合氯醛（0.6 mL/100 g）麻醉大鼠，沿腹中線切口暴露盲腸，用5-0絲縫線結(jié)扎盲腸中點處。用pH 7.4磷酸的鹽緩沖液PBS浸泡盲腸，18號針頭由腸系膜側(cè)向非腸系膜側(cè)刺穿盲腸。然后，將盲腸放回腹腔，縫合腹部切口。假手術(shù)組僅開腹，不進行盲腸結(jié)扎和穿孔，其余操作與其他2組相同。建模前1周進行預(yù)處理：治療組小鼠腹腔注射辛伐他汀0.2 μg/g（由辛伐他汀5 mg+0.5 mL無水乙醇+0.9%氯化鈉溶液500 mL配制，注射體積 0.02 mL/g），每12 h 1次，連續(xù)注射1周；假手術(shù)組和膿毒血癥組腹腔注射安慰劑 0.02 mL/g（由0.5 mL無水乙醇+0.9%氯化鈉溶液500 mL配制），每12 h 1次，連續(xù)注射1周。于建模后24 h取材，用于下一步實驗。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和脂鈣蛋白2（lipocalin 2，LCN2）的檢測

分離大鼠氣管及主支氣管后進行氣管插管，0.5 mL預(yù)冷PBS灌洗左肺3次，收集BALF。BALF 1 500g，4℃，離心10 min，收集上清液。蛋白定量試劑盒（Bio-Rad Co.，美國）對BALF中蛋白含量進行測定，嚴格按照試劑盒說明書操作。酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（R&D Systems Inc.，美國）檢測BALF中TNF-α和LCN2的濃度。BALF中的細胞進行瑞氏吉姆薩染色后，利用光學(xué)顯微鏡進行多形核中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）計數(shù)。

1.4 肺組織氧化應(yīng)激檢測

取左肺組織勻漿，1 500g，4 ℃，離心15 min。采用硫代巴比妥酸法測定上清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.5 肺水腫評價

采用濕重/干重（wet weight/dry weight，W/D）法評估肺水腫情況。建模24 h后，收集各組大鼠右肺上葉。濾紙吸走表面殘余水分及血液，稱質(zhì)量（濕重）；然后，將肺組織在80 ℃下干燥24 h后，再稱質(zhì)量（干重）。最后計算肺組織W/D。

1.6 肺組織的病理學(xué)評估

取大鼠右肺中葉組織，預(yù)冷PBS沖洗3次，10%中性甲醛固定24 h。肺組織進行常規(guī)脫水、透明以及石蠟包埋。將石蠟包埋的肺組織進行4 μm連續(xù)切片后，二甲苯脫蠟，不同梯度濃度乙醇脫水，蘇木精染色5 min，伊紅染色2 min。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。根據(jù)肺泡滲出物、肺間質(zhì)充血水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡出血和細胞增生5項指標對肺組織結(jié)構(gòu)完整性進行評估。每項指標分為無病變、輕度病變、中度病變和嚴重病變，得分依次為0、1、2和3分。各指標評分相加即為肺組織結(jié)構(gòu)受損程度的總得分，得分越高表示受損越嚴重［5］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠BALF中各檢測指標比較

膿毒血癥組BALF中總蛋白、LCN2和TNF-α水平及PMN計數(shù)均顯著高于假手術(shù)組（均P＜ 0.05），治療組BALF中上述各指標均明顯低于膿毒血癥組（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠 BALF中總蛋白、TNF-α、LCN2水平及PMN計數(shù)比較（）Tab.1 Comparison of total protein，TNF-α，and LCN2 concentrations and PMN count in BALF from rats in all groups（）

表1 3組大鼠 BALF中總蛋白、TNF-α、LCN2水平及PMN計數(shù)比較（）Tab.1 Comparison of total protein，TNF-α，and LCN2 concentrations and PMN count in BALF from rats in all groups（）

1）P ＜ 0.05 vs sham group；2）P ＜ 0.05 vs sepsis group.

2.2 3組大鼠肺組織MDA水平及SOD活性和肺水腫情況比較

與假手術(shù)組相比，膿毒血癥組大鼠肺組織MDA水平顯著升高，SOD活性則顯著降低，W/D比值顯著升高（均P＜ 0.05）。辛伐他汀治療可顯著降低肺組織MDA水平，提高SOD活性，降低W/D比值（均P＜0.05），見表2。

表2 3組大鼠肺組織MDA水平、SOD活性及W/D比值比較（）Tab.2 Comparison of MDA content，SOD activity，and W/D ratio in lung tissues from rats in all groups（）

表2 3組大鼠肺組織MDA水平、SOD活性及W/D比值比較（）Tab.2 Comparison of MDA content，SOD activity，and W/D ratio in lung tissues from rats in all groups（）

1）P ＜ 0.05 vs sham group；2）P ＜ 0.05 vs sepsis group.

2.3 3組大鼠肺組織病理學(xué)改變比較

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡形態(tài)清晰，無充血或水腫。膿毒血癥組大鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，肺泡充血、水腫，肺泡壁增厚。辛伐他汀治療可顯著改善膿毒血癥導(dǎo)致的炎癥細胞浸潤、肺泡充血和水腫現(xiàn)象（圖1）。此外，假手術(shù)組、膿毒癥組及治療組肺組織病理評分分別為1.3±0.12、8.8±0.48和5.6±0.63，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 光鏡下3組大鼠肺組織HE染色×200Fig.1 H&E staining results of lung tissues from rats in all groups under light microscope × 200

3 討論

ALI是膿毒血癥最常見的組織損傷［6］。肺泡-毛細血管屏障的上皮和內(nèi)皮層損傷和破壞，進而導(dǎo)致炎癥細胞聚集到肺泡腔是ALI的典型特征［7］。本研究結(jié)果顯示，膿毒血癥導(dǎo)致大鼠支氣管肺泡灌洗液中總蛋白量顯著升高，表明內(nèi)皮通透性增加；支氣管肺泡灌洗液中LCN2和TNF-α含量以及PMN計數(shù)升高，肺組織W/D比值升高，MDA升高和SOD活性下降，表明膿毒血癥促進局部炎性細胞因子釋放和中性粒細胞聚集，并提高氧化應(yīng)激水平，繼而導(dǎo)致肺水腫和肺實質(zhì)損傷。辛伐他汀治療顯著降低了BALF中總蛋白、LCN2、TNF-α水平和PMN計數(shù)；降低肺組織MDA水平，提高SOD活性；降低肺W/D比值；減輕肺組織炎癥細胞浸潤、肺間質(zhì)充血和水腫。因此，辛伐他汀可能通過改善內(nèi)皮屏障功能，減輕肺組織炎癥反應(yīng)和抑制過度氧化應(yīng)激的途徑減輕膿毒血癥大鼠的ALI。

膿毒癥時細菌毒素激活巨噬細胞/枯否細胞，誘導(dǎo)其釋放促炎細胞因子及其他啟動特異性免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)。此外，研究［8］表明，包括TNF-α和IL-6在內(nèi)的促炎細胞因子在膿毒癥導(dǎo)致的組織損傷中發(fā)揮重要作用。TNF-α可活化肺組織的中性粒細胞，促進其產(chǎn)生大量的包括顆粒酶、活性氧、生物活性脂類、多種促炎細胞因子等細胞毒性物質(zhì)，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進而造成組織損傷［9］。LCN2與乳鐵蛋白、鈣衛(wèi)蛋白（S100A8/A9）或Mac-1（CD11b/CD18）一起儲存于特異性顆粒中，促進中性粒細胞效應(yīng)功能的發(fā)揮和遷移［10-11］。此外，LCN2可抑制卵巢透明細胞癌細胞內(nèi)鐵相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)［12］，并高表達于臭氧誘導(dǎo)的受損肺組織中［13］。炎癥狀態(tài)下核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化可刺激IL-6和LCN2表達增加［14］。本研究結(jié)果顯示，TNF-α和LCN2等細胞因子在膿毒血癥致肺損傷的發(fā)生中具有重要作用，辛伐他汀通過抑制多種炎性細胞因子的過量表達，對膿毒血癥導(dǎo)致的ALI產(chǎn)生保護作用。

脂多糖可激活中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞，引起炎性細胞因子和氧自由基的過度釋放，通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，和直接對蛋白質(zhì)、核酸的破壞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，引起細胞凋亡，導(dǎo)致膿毒血癥ALI［15］。本研究結(jié)果顯示，膿毒血癥組大鼠肺組織MDA含量升高、SOD活性降低。光鏡下，膿毒血癥組大鼠肺組織病理損傷嚴重；辛伐他汀治療可顯著降低肺組織MDA含量、增加SOD活性，減輕炎癥細胞浸潤和肺間質(zhì)充血、水腫及肺組織病理損傷。提示辛伐他汀減輕膿毒血癥大鼠ALI的機制與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，辛伐他汀治療能一定程度上減輕膿毒血癥大鼠的肺損傷，其機制可能為辛伐他汀能夠改善內(nèi)皮通透性，降低肺組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕肺損傷，本研究為辛伐他汀用于臨床治療膿毒血癥提供了理論基礎(chǔ)。