馬立克氏病病毒活載體疫苗的研究進展

王子書

（徐州市賈汪區畜牧獸醫站 江蘇徐州 221011）

馬立克氏?。╩arek's disease，MD），是當前危害養雞業健康發展的主要禽類傳染病之一，是由馬立克氏病病毒（marek's disease virus，MDV）引起的一種高度接觸性腫瘤病，以外周神經、虹膜、性腺、肌肉、各種內臟器官和皮膚等處形成淋巴腫瘤為主要特征[1,2]。目前，MDV 已發現的有3 個血清型，即致病性的血清I 型（MDV-1），根據其毒力分為弱毒株（mMDV）、強毒株（vMDV）、超強毒株（vvMDV）和特超強毒株（vv+MDV）[3]；血清II 型（MDV-2）是非致瘤性的自然弱毒株；血清III 型（MDV-3）是火雞皰疹病毒（herpes virus of turkey，HVT）。其中，血清I 型中的vvMDV 和vv+MDV 的一些野毒株能在免疫過CVI988/Rispens 株的雞群中引發嚴重的疾病。MDV 的主要宿主是雞，傳染源為病雞和帶毒雞，病毒從羽毛囊中排出，經呼吸道侵入機體內。MD 病程較長，雛雞易感，死亡率較高，目前針對MD 尚無特效治療藥物，但已研發了有效的商品疫苗。但隨著MDV 毒力的不斷增強，其流行及危害也不斷上升，嚴重損害養雞業的經濟效益。因此，研發安全有效的疫苗迫在眉睫。

疫苗包括傳統疫苗和新型疫苗。目前傳染病流行情況復雜，抗原變異迅速，滅活疫苗只能誘導體液免疫，且接種劑量大，需添加佐劑，成本過高，在滅活的過程中，還可能存在滅活不完全、病毒逃逸等風險。弱毒疫苗雖產生免疫力快，但存在致弱毒株毒力返強的風險，還可能加劇病毒的變異[4]。隨著基因工程技術的發展，用活病毒作載體來表達異源基因的重組活載體疫苗為當前疫苗研究的熱點?；蚬こ讨亟M活載體疫苗是利用基因工程技術將一種或幾種病原的保護性抗原基因插入到活載體中并使之在體內表達出保護性抗原的活疫苗[5]。該類疫苗不僅免疫效力高，能夠誘導機體產生的免疫比較廣泛，還兼具成本和安全優勢，能同時表達多個外源基因可制成多價或多聯疫苗，達到一針防多病的目的，簡化免疫程序，能克服不同病毒弱毒苗間產生的干擾現象，減輕了動物的應激反應，具有廣泛的應用前景，是當今及未來疫苗研發的主要方向之一。

1 MDV 作為疫苗載體的優勢

MD 作為可用疫苗預防的腫瘤性疾病，接種疫苗是有效控制MD 的主要手段。HVT 是最早能安全有效控制MD 的疫苗，MDV-2用作疫苗的保護力較低，但將HVT 和MDV-2 聯合應用時，產生的保護效力會提升，這種保護性協同作用已被證明對MDV-2 和MDV-3 組合具有特異性，但不適用于MDV-1 和MDV-2，因此，MDV-2 病毒通常用于二價或三價疫苗制劑[6]。自20 世紀70 年代以來，HVT、HVT+SB-1 雙價疫苗、CVI988/Rispens 株弱毒活疫苗和814 疫苗等都曾先后成為有效預防MD 的疫苗?；蚬こ碳夹g為開發MD 疫苗提供了新路徑，MDV 屬于α-皰疹病毒，是大分子DNA病毒，其弱毒株可作為表達外源基因的病毒載體[7]。MDV 作為載體目前受到廣泛關注，它有以下優點：①MDV 載體疫苗可胚內或1 日齡接種，誘導早期免疫保護，并且產生較長時間的免疫反應，有利于外源蛋白的持續表達，免疫保護效果較為理想；②MDV 基因組龐大，可插入多個或較長的外源基因，有利于構建多價或多聯重組活載體疫苗，而且遺傳穩定；③MDV 為細胞結合型病毒，可突破母源抗體的干擾；④MDV 載體疫苗既能預防MD，還可預防其他的病毒性家禽疾病，且MDV 的自然宿主僅限于禽類，對其他家畜和人類是安全的[8]。

2 病毒載體的構建方法

目前構建MDV 重組活載體疫苗主要采用的是同源重組法（homologous recombination，HR）和細菌人工染色體法（bacterial artificial chromosome，BAC）。因MDV 基因組龐大，利用同源重組法構建過程繁雜，效率較低。隨著分子生物學技術的發展,利用BAC 技術，通過同源重組法將BAC 載體功能序列mini-F 插入到病毒基因組中的某個位點，用獲得的重組病毒基因組DNA 轉染細胞，采用有限稀釋法純化出重組病毒[9]。該方法可以方便地在體外操作，而且具有遺傳穩定、容量大、操作簡單等優點，應用前景十分廣闊。但BAC 自身的序列難以去除，導致獲得的重組病毒帶有非必要的外源基因序列，存在安全隱患。除了以上兩種方法，目前采用的還有Fosmid多片段拯救系統、CRISPR/Cas9 系統等基因編輯技術。CRISPR/Cas9與同源重組和BAC 技術的優勢在于操作簡便、成本低及無外源基因干擾等。

3 MDV 活載體疫苗的研究進展

近年來，國內外研究人員都在致力于重組MDV 活載體疫苗的研制，多家實驗室已經成功構建了重組MDV 疫苗。HVT 是構建表達外源抗原基因重組活載體疫苗和誘導產生保護性免疫最有效的載體之一，普遍使用的方法是將HVT 基因組克隆到黏粒（cosmid）或細菌人工染色體（BAC）中，利用反向遺傳操作，使其他病毒的保護性抗原基因能夠快速定向性地插入到HVT 基因組中[10]。用HVT重組病毒表達MDV-1 抗原的優點是二者有交叉抗原反應且HVT在雞體內維持時間長，因此可用大量的HVT 蛋白來誘導免疫反應[11]。由于HVT 的疫苗生產成本低，可凍干，使用方便，易于保存和運輸；同時，HVT 對雞無致病性，不產生任何副作用，也不發生水平傳播，從而降低了重組活載體疫苗散毒的風險。例如，以HVT 為載體構建表達MDV gB 基因的重組病毒，具有MDV-HVT 二價苗優點的同時更安全且易保存。1992 年Nilkura 等[12]以HVT 為載體，構建出表達MDV gB 基因的重組病毒在保證安全性的基礎上保留了與HVT 同等的免疫效果。研究表明，與傳統IBDV 疫苗相比，rHVT-VP2 重組疫苗對預防雞傳染性法氏囊病十分有效，不僅對法氏囊沒有損害，而且在含有母源抗體的雞中也能誘導產生很好的免疫保護效果，在國內外市場取得了巨大成功，已作為商業化疫苗廣泛應用于商品雞中。此外，研究表明MDV-2 和HVT 疫苗之間存在協同保護作用，因此將MDV-2 用作載體前景廣闊[13]。

然而，由于MDV 毒力不斷增強，HVT 防控效果正在減弱，利用MDV-1 疫苗作為載體更具有現實意義。20 世紀90 年代，MDV-1開始作為表達IBDV、NDV、AIV 的載體。1999 年，有學者[14]采用CVI988 疫苗株為載體，構建了表達IBDV VP2 基因的重組MDV 疫苗，對MD 和IBD 有較強保護力。Cui 等[15]以MDV-1 為載體構建的rMDV-HA 重組疫苗獲得了比以HVT 為載體的rHVT-HA 重組疫苗更好的免疫保護效果。李凱[16]用MDV-1 弱毒疫苗株814 作為載體，構建表達IBDV VP2 基因的重組MDV 活載體疫苗有望成為一種可以同時高效預防IBDV 和MDV 的二聯活疫苗。近年來，國內多家實驗室利用MDV 的常規疫苗成功構建了多個重組MDV 疫苗。

4 結論與展望

多數研究表明，活載體疫苗的研究和應用具有廣闊的開發前景?；蛑亟M活載體疫苗有望成為今后控制MD 的主要疫苗，關于重組MDV 活載體疫苗的研究進展明顯，多種病原體保護性抗原在MDV 載體中成功表達，部分重組MDV 活載體疫苗已取得獸藥證書，為進一步控制MD 提供可能。但也存在一些局限性。例如，哪些病毒基因與免疫或毒力有關，以及必須表達哪些基因組合才能生產出有效的疫苗，目前的知識尚且有限，還需要更多研究。此外，對MDV 的先天性和適應性免疫反應以及現有疫苗的保護機制還不是完全了解，對涉及MDV 在感染和傳播中的基因也需要更加深入地了解[17]。為構建出理想的MDV 重組疫苗，不僅要考慮影響重組疫苗效果的關鍵因素，例如抗原基因、病毒載體、插入位點等方面的選擇，還要兼顧生物安全性，因此常規使用的疫苗株是構建MDV 載體的最佳選擇。未來基因重組活載體疫苗的發展應該以提高疫苗的安全性與靶向性為主要方向，為畜禽等動物傳染性疾病防治以及食品安全提供重要保障。■