骨髓間充質干細胞通過調節免疫及炎性反應治療膝骨性關節炎機制的研究進展

張文豪綜述 向文遠,方銳審校

骨性關節炎(osteoarthritis,OA)是一種由于關節軟骨細胞和軟骨退化引起的退行性病變,關節軟骨細胞、細胞外基質以及軟骨下骨的合成失衡是退化過程中的一種病理特征[1]。關節軟骨是關節面的重要組成部分,可起到緩沖、促進關節液流動和分散下肢力學傳導等作用。膝關節軟骨退化后,降解產物可引起軟骨細胞凋亡,造成軟骨損傷,并伴有軟骨下骨和滑膜的改變。目前,早期OA的治療包括使用抗炎鎮痛藥物、軟骨保護藥物、關節鏡下清理等方法[2]。但這些措施只能緩解臨床癥狀,輕度改善患者生活質量,并不能延緩OA的退變,特別是對于晚期OA的效果更是不佳。晚期OA可采用人工膝關節假體表面置換術,緩解疼痛,提高生活質量,然而,關節置換后的一系列并發癥及費用等問題也極大限制人工關節置換的應用[3]。

間充質干細胞 (marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是再生醫學中理想的種子細胞,不僅具備多向分化、自我更新以及免疫調節和抗炎的特點,還參與損傷組織的修復[4],這為OA治療提供一種新思路, BMSCs是一種來源于骨髓基質的具有多向分化潛能及自我更新的干細胞,BMSCs 可以分化為不同類型的組織,包括脂肪、軟骨和骨骼;BMSCs 還可以進行自我更新并產生免疫調節反應,BMSCs 在軟骨損傷和關節疾病的治療中得到了積極的應用[5]。因此通過查閱相關研究,對BMSCs通過免疫反應和炎性反應治療OA的主要機制做一綜述,為BMSCs對OA的診療提供新的思路。

1 BMSCs治療OA的免疫反應機制

膝關節滑膜炎是OA發生發展過程中的重要病理變化過程,其主要特征是滑膜組織增生,而引起巨噬細胞聚集和軟骨細胞分泌功能障礙,故膝關節滑膜炎與滑膜巨噬細胞的極化密切相關,巨噬細胞極化與OA的發生發展同樣密切相關[6]。巨噬細胞在不同微環境下可分為經典激活的M1巨噬細胞和交替激活的M2巨噬細胞兩種極化狀態[7]。M1巨噬細胞在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和干擾素-γ(IFN-γ)刺激后,分泌大量促炎細胞因子,如白介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等,引發機體的免疫及炎性反應[8]。BMSCs通過其分泌的外泌體對巨噬細胞進行調節,外泌體是直徑30～150 nm的囊泡結構,其含有多種成分,包括蛋白質、DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA),在細胞間通訊中發揮著重要作用[9]。而間充質干細胞來源外泌體的調節主要通過促進巨噬細胞從 M1向M2的極化來延緩OA進展[10]。He等[11]研究表明,間充質干細胞來源外泌體的miR-223可促進M2巨噬細胞的極化,加速皮膚傷口的愈合。細胞外小泡(extracellular vesicles,EVs)是另一個調節巨噬細胞免疫途徑的方式,可產生與外泌體相似的治療效果;Li等[12]發現人臍帶間充質干細胞胞源性EVs可以通過傳遞miRNAs和相關蛋白來調節PI3K-Akt信號通路, 減緩OA進展。

OA患者滑膜中存在T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞浸潤,說明免疫細胞在OA的發病機制中扮演重要角色[13]。T細胞是OA滑膜液中淋巴細胞的主要成分,根據功能的不同,T細胞可分為輔助性T細胞(Th細胞)、細胞毒性T細胞(TC細胞)和調節性T細胞(Tregs),前兩者統稱為效應性T細胞,Th細胞可分為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞, Th17細胞主要生成IL-17和IL-23,這兩種細胞因子的過度表達促進免疫細胞的滲透、血管內皮生長因子的分泌以及微血管生成,進而加劇軟骨退變[14]。高水平的CD4+T細胞(激活后分化為Th細胞)和CD8+T細胞亞群(激活后主要分化為TC細胞),對于OA的發病具有重要意義[15]。同時隨著軟骨基質的分解產物暴露出來,B細胞可以被刺激產生自身抗體,如軟骨間皮素、骨橋蛋白、蛋白多糖,激活體液免疫致關節微環境的紊亂[16]。故T細胞在OA的發生及發展中產生了重要作用,而如何通過BMSCs減少效應T細胞的生產以及增加調節性T細胞的產出,減緩關節軟骨的退變,是下一步進行研究的重要方向。

Ogawa等[17]研究發現小鼠BMSCs分泌的一氧化氮可直接暫停細胞周期來調節T細胞的免疫抑制反應,以及BMSCs分泌的細胞因子如TGF-β和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF),吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3- dioxygenase,IDO)來抑制T細胞的增殖并誘導活化的T細胞凋亡[18]。色氨酸是維持T細胞激活和增殖所必需的氨基酸。當色氨酸濃度較低時,T細胞增殖受阻于G1期,導致T細胞數量減少,IDO介導的色氨酸只抑制激活的T細胞,而不抑制靜止的T細胞[19]。BMSCs分泌的細胞因子不僅可以抑制T細胞的增殖和誘導其凋亡,還可以抑制初始T細胞的活化,改變T細胞亞群的分化過程。MSCs分泌的細胞因子可抑制促炎T細胞并誘導Tregs導致TNF-α和IL-12的產生減少,而IL-10的產生增加,當微環境中的IL-10濃度達到一定水平時,分泌人類白細胞抗原-G5(HLA-G5),減弱CD4+T細胞對TH1和TH17的激活,并誘導Treg的產生從而形成正反饋循環[20]。BMSCs與T細胞的直接接觸在T細胞的免疫調節中也起著重要作用,如細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達是BMSCs通過增加BMSCs與T細胞之間的黏附而對T細胞發揮免疫抑制作用[21]。這說明BMSCs通過分泌細胞因子,減少TNF-α等促炎因子的生產,而增加IL-10等抗炎因子的作用,該方式在免疫抑制作用中發揮重要作用。

BMSCs對B細胞的調節不僅通過分泌細胞因子,而且通過細胞間的接觸,BMSCs抑制B細胞中絲氨酸/蘇氨酸激酶和p38絲裂原激活蛋白激酶的磷酸化,而促進了ERK1/2的磷酸化[22]。另一研究發現,BMSCs可通過上調IL-10顯著增強B細胞的免疫調節活性[13]。Chen等[23]發現BMSCs可調節CD23+、CD43+Breg細胞,從而抑制促炎細胞因子的分泌和T細胞的增殖。Rafei等[24]發現BMSCs通過趨化因子CCL2抑制轉錄因子信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)的表達,進而通過誘導配對的PAX5蛋白質合成,從而抑制漿細胞中免疫球蛋白的分泌。BMSCs被證明具有廣泛的免疫調節能力,并能夠抑制在OA發生和發展中的大部分免疫細胞。在旁分泌(細胞間接觸)和旁分泌方式(通過產生可溶性因子)中,BMSCs抑制炎性M1巨噬細胞的激活,促進其向抗炎、M2表型的轉化;抑制NK細胞的增殖和細胞毒性,防止自身反應性B細胞的激活和自身反應性抗體的產生,抑制炎性CD4+Th1細胞的激活,促進免疫抑制的CD4+T調節細胞(Tregs)的產生,從而能夠減輕關節炎性反應[25]。另一個方面,BMSCs通過抑制NK細胞產生IFN-γ,促進髓系來源的抑制細胞TGF-β,細胞通過CD-39/CD-73/ADO途徑,將表達CD73的BMSCs與表達CD39的活化T細胞共同發揮免疫調節作用,如抑制血小板聚集和活化,激活T細胞,降低NK細胞活性,誘導CD73+NK細胞使其處于靜止狀態[26]。骨髓間充質干細胞表達和分泌程序性細胞死亡配體1(PD-L1)及程序性細胞死亡配體2(PD-L2),BMSCs表面的PD-L1與B細胞表面的PD-1相互作用,抑制B細胞的增殖和漿細胞分化[15,18,26]。總之,BMSCs可從B細胞和T細胞的多個方面去減少免疫反應對OA軟骨細胞造成的損傷,減緩OA的進展。

BMSCs的免疫調節是通過旁分泌以及通過廣泛的生物活性分子,包括細胞因子、趨化因子、生長因子等細胞與細胞之間的接觸來進行的,從而影響天然免疫和獲得性免疫[26]。PGE2是一種由環氧合酶-1(COX-1)和環氧合酶-2(COX-2)產生的花生四烯酸的脂質中間體,這兩種酶通常由BMSCs合成,雖然不同來源BMSCs都合成PGE2,但合成劑量及效能存在差異性[27]。PGE2與免疫細胞上的受體EP2和EP4相互作用,通過激活腺苷環化酶,增加細胞內CAMP的水平,導致抗炎細胞因子(IL-4、IL-5、IL-10)的表達,并以IL-2依賴的方式抑制促炎細胞因子產生,而且抑制NK細胞產生IFN-γ,促進產生TGF-β,PGE2還通過促進Th-2和抑制Th-1發揮免疫抑制作用[22,25]。

肝細胞生長因子(HGF)是一種由BMSCs表達和分泌的免疫調節細胞因子,通過HGF受體作用于CD14+單核細胞,通過ERK1/2途徑誘導IL-10的產生,CD14+調節T細胞從Th1到Th2變化[28]。由BMSCs表達的人類白細胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLAG)可與多種免疫細胞表面的受體結合產生免疫調節作用,比如通過減少NK細胞、細胞毒性T細胞的殺傷、同種異體T細胞的增殖、樹突狀細胞成熟等途徑[29],還可通過抑制Th1/Th17細胞因子的分泌以及誘導Th2型細胞產生高水平IL-10,抑制NK細胞分泌IFN-γ,減輕免疫反應[15,22,26]。腫瘤壞死因子刺激基因6(tumor necrosis factor stimulated gene 6 ,TSG6)是BMSCs參與免疫調節作用的重要因子,TSG6通過直接調節中性粒細胞與內皮的黏附,促進調節性T細胞的擴張,并抑制中性粒細胞的聚集,通過與巨噬細胞上的CD44結合,干擾TLR2/NF-κB途徑,導致中性粒細胞的滲透減少,并與透明質酸片段結合,從而減弱其促炎作用[30]。BMSCs表達可溶性蛋白質(galectins,Gal)與細胞表面糖蛋白結合,Galectin-1調節樹突狀細胞遷移、信號和分化,并抑制淋巴細胞和中性粒細胞向炎性組織的聚集,Galectin-1和Sema-3A一起與T細胞上表達的受體NP-1結合,抑制T細胞的增殖,從而抑制炎性反應,Galectin-9與Th1細胞表面受體TIM-3特異性結合,誘導Th1細胞死亡,Galectin-9可損害B細胞的增殖和活性[31],從而延緩OA的發生與發展,但是其具體通路及機制仍需進一步研究。

補體系統是先天防御機制的組成部分,主要作用是保護宿主免受感染。一旦激活,補體蛋白作為趨化因子和炎性大因子發揮作用,導致受損細胞和組織的細胞溶解,補體系統由30多種蛋白質組成,它可以通過3種不同的途徑激活:(1)經典途徑;(2)MBL途徑;(3)旁路途徑。這3種途徑中的每一種都會導致產生惰性的C3轉化酶,它將C3裂解成C3a和C3b,可以參與形成不同的復合物。最終,補體級聯的結果是激活C5,啟動C5b-7復合物的形成,最終形成膜攻擊復合物(membrane attack complexes,MAC),導致細胞裂解[32]。間充質干細胞具有免疫特權,可以逃避宿主免疫系統的監視,其原因是其強大的免疫抑制活性的特性。BMSCs可表達可溶性因子H,補體調節蛋白CD46、CD55和CD59,使BMSCs能夠在一定程度上抑制補體系統的激活[33-34]。

2 BMSCs治療OA的炎性反應機制

OA過度激活引起的炎性反應造成膝關節軟骨退變加劇,BMSCs通過M2巨噬細胞抗炎作用,分泌抗炎細胞因子,如IL-4、IL-10和TGF-β,抑制炎性反應的過度激活,從而抑制OA的進展[8]。MSCs 源性EVs同時促進M2巨噬細胞的極化,下調促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,上調抗炎細胞因子IL-10的水平,TGF-β和其他抗炎細胞因子(IDO、PGE-2、IL-10)可誘導巨噬細胞極化為M2抗炎表型,其中前列腺素E2(PGE-2)可以與巨噬細胞表面的EP2和EP4受體結合,改變下游基因的表達,并導致巨噬細胞向M2表型轉化。這表明外泌體、EVs和巨噬細胞極化在膝骨性關節炎的發展和治療中的重要性。它們提供了潛在的治療策略,通過調整巨噬細胞的極化狀態和調節炎性因子的表達,有助于減輕膝骨性關節炎的炎性反應,并促進修復和再生過程[12]。中性粒細胞通過聯合單核細胞和其他免疫細胞產生抗炎和愈合能力,進而可分為促炎中性粒細胞(N1)和抗炎中性粒細胞(N2)[35]。Cai等[36]研究發現中性粒細胞可與BMSCs的相互作用,不同水平的IL-8被認為是一種中性粒細胞趨化細胞因子。在小鼠實驗模型中,觀察到損傷的軟骨出現類骨折血腫的現象,N2極化后向BMSCs分泌基質細胞衍生因子1α(SDF-1α),通過SDF1/CXCR4途徑及其下游的PI3K/AKT途徑,可促進軟骨的修復。OA患者關節液中存在中性粒細胞彈性蛋白酶,可通過激活PAR2及MMP-13產生一系列反應造成軟骨損傷,而BMSCs可抑制PAR2的激活,減輕軟骨損傷[37]。另一研究發現通過敲除小鼠PAR2基因,發現PAR2有助于BMSCs的成骨分化,而不是脂肪生成,以及抑制BMSCs的IL-6表達似乎是PAR2抑制脂肪形成的一個機制,從而減少骨質疏松的發生[38]。Akbar等[39]發現BMSCs可產生α-抗胰蛋白酶,減少軟骨損傷的同時避免骨質疏松。綜上所述,OA的發生與中性粒細胞的發生密切相關,同時BMSCs從多個方面減輕中性粒細胞對軟骨細胞的損傷,并通過其多向分化潛力促進軟骨的修復。

OA一直被認為是一種軟骨退行性疾病,但炎性反應在其發病機制中起著至關重要的作用,由炎性激活的先天性免疫受體(也稱為危險信號)引發軟骨細胞變性,BMSCs可通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)發揮其大部分功能,TLRs是由2個結構域組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其一是富含亮氨酸重復序列(leucine- rich repeat,LRP)的結構域,用于識別病原體相關的分子形式(pathogen- associated molecular patterns,PAMPs);其二是Toll/IL-1受體(Toll/IL-1 receptor,TIR)結構域,它激活的適配分子包括髓系分化初級反應、TIR結構域受體相關蛋白、TRIF相關適配分子和含有TIR結構域的蛋白誘導干擾素-β[40]。哺乳動物細胞質膜上的TLRs主要是TLR4(主要適應于識別LPS和跨質膜并轉發LPS信號),它可以檢測微生物細胞表面成分,TLR5識別鞭毛蛋白,TLR1、2和6檢測細菌脂蛋白,TLR3專門檢測雙鏈RNA(dsRNA),TLR9是一個未甲基化的含CpG的ssDNA的受體,TLR13能識別細菌核糖體RNA,OA患者中,TLR4與BMSCs與其外泌體的作用機制及其信號通路是研究的熱點[41]。

在BMSCs成骨、成脂和成軟骨誘導下,TLR4的表達增加,TLR4的應力誘導配體(FnIII-1c)在分化早期促進成骨,TLR4基因敲除抑制了成骨和部分軟骨生成,并促進了脂肪生成,而在MSCs向成骨細胞分化的早期,脂多糖刺激下TLR4的表達顯著增加,然后逐漸下降,但脂多糖可導致成骨細胞TLR2和TLR4表達下調,而內毒素負面調節TLR4的表達,從而影響BMSCs成骨、成脂和成軟骨的分化[41-42]。脂多糖結合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)和CD14促進了內毒素向TLR4/MD2復合體的轉移,內毒素向分子復合體的轉變是激活免疫系統所必須的,而TLR4受體復合體的異質性隨著TLR4的激活而變化[41,43]。TGF-β1可調節免疫系統,而脂多糖誘導的BMSCs中可增加膠原沉積,進而誘導BMSCs中纖維連接蛋白的沉積增加,這與TGF-β1水平的降低有關[20,26, 41]。因此,作用于配體的時間、配體的類型、分化階段、TLR刺激途徑(內源性或外源性)、配體的濃度、細胞的類型和種類都會影響BMSCs的分化潛能,甚至對OA內在機制的免疫調節也產生重要作用。

3 小結與展望

OA的發病機制不僅涉及軟骨損傷和力線改變,還與免疫及炎性反應方面有著密切關系。BMSCs在免疫及炎性反應調節和組織再生方面具有潛力,根據OA的發病機制,結合BMSCs的免疫及炎性反應調節作用,可以提前解決免疫和炎癥因素對OA的影響,并聯合最新的靶點治療,作為治療和預防早中期OA的有效方式,對于中期OA,可以依靠BMSCs的修復能力來治療損傷的軟骨。然而,無論采用何種方式,利用BMSCs治療OA的方法仍不夠成熟,還需要進一步探索和研究BMSCs在防治OA方面的機制,以提供更精準、安全和有效的治療方案。下一步展望應著重進一步研究OA的發病機制和誘因,以更全面地了解OA的病理過程和影響因素。深入研究BMSCs在免疫及炎性反應調節和組織再生方面的作用機制,以提高其在OA治療中的效果和安全性。探索和開發更多的靶點治療方法,結合BMSCs的免疫及炎性反應調節作用,以提供更多個性化的治療選擇。進一步優化和改進利用BMSCs治療OA的方法,以提高治療效果和預防并發癥的發生。加強臨床實踐和研究的結合,開展大規模的臨床試驗,以驗證BMSCs治療OA的安全性和有效性;推動BMSCs治療OA的臨床應用,為患者提供更為精準、安全和有效的治療方案。