慢性炎癥傷口的蠶絲基敷料研究進展

李萌萌, 王自立, 高玉潔, 吳金丹

(浙江理工大學 先進紡織材料與制備技術教育部重點實驗室,杭州 310018)

皮膚是保護身體免受外部傷害的第一道屏障,具有分泌、吸收、感覺和調節體溫等功能[1]。皮膚一旦受損形成傷口,則會導致其失去部分功能。采用適當的敷料對傷口進行管理,避免感染或炎癥發生,促進傷口愈合和皮膚修復,具有重要的意義[2]。與傳統醫用紗布或繃帶相比,近年來開發的新型傷口敷料,如納米纖維敷料[3]、泡沫敷料[4]、水凝膠敷料[5]等,因具有豐富的功能而受到廣泛的關注。

根據基體材料的來源,敷料可分為天然高分子基敷料和合成高分子基敷料[6]。其中,天然高分子基敷料普遍具有生物相容、可生物降解、與細胞親和力高等優點;而且,其所含有的活性因子或基團,有利于細胞生長和傷口愈合,因此備受研究者青睞[7]。目前,常見的用于制備天然高分子基敷料的原料包括膠原、明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸和蠶絲蛋白等[8]。

蠶絲是一種天然蛋白質纖維,主要由70%～80%的絲素和20%～30%的絲膠組成,且外層的絲膠包裹著芯層的絲素[9-11]。絲素通常由蠶絲脫膠得到,具有優異的力學性能、較低的免疫原性、良好的抗炎作用及透氣性,能夠促進細胞的黏附、增殖、遷移和分化[12-14]。絲膠在絲綢工業中通常被當作副產物丟棄[15-16],且在早期人們對絲膠的誘導炎癥作用、致敏性和免疫原性等也存在擔憂[17-19],使其在生物醫學應用方面的研究進展緩慢。但近年來,越來越多的研究證明了絲膠的安全性,并揭示了其具有天然的抗氧化、抗炎、抗凝、抗菌、抑制細胞凋亡、促進細胞分化等生物活性[20]。此外,由于蠶絲蛋白的氨基酸序列上具有多種活性側基,如氨基、羥基、羧基和巰基等[21-22],因而蠶絲基敷料不僅易于被修飾和改性,還可通過多種作用力負載活性因子、抗菌劑、抗炎藥等組分,從而提高敷料的功能性。

目前,大量的文獻關注新型敷料的抗菌[23]、促修復[24]功能。對于慢性難愈合傷口而言,長期的炎癥問題更為棘手[25]。因此,具有抗炎功能的敷料亦應受到關注。本文聚焦于蠶絲蛋白的抗炎特性,簡要介紹了其抗炎機制,綜述了納米纖維、水凝膠等多類抗炎蠶絲基傷口敷料的構建方法及其在傷口修復領域的應用現狀,并分析了該研究領域面臨的挑戰和未來的發展方向。

1 蠶絲蛋白抗炎機制

一般來說,皮膚傷口的修復過程包括四個連續的階段:止血期、炎癥期、增殖期和重塑期[26]。其中,炎癥期在損傷后數小時內啟動。在該階段,中性粒細胞首先被募集到損傷區,產生大量的活性氧和蛋白酶用于殺傷病原微生物。隨后,巨噬細胞(M1型)及淋巴細胞遷移到損傷區,對細胞碎片、病原微生物等進行清除[27]。由此可見,適度的炎癥反應有利于皮膚傷口抵御感染,進而促進其愈合。然而,過度的中性粒細胞浸潤和長期存在的M1型巨噬細胞會延長炎癥期,加重組織損傷,導致傷口無法向抗炎狀態發展,阻礙增殖期啟動,最終影響傷口的愈合[28]。據報道,蠶絲蛋白可以抑制與炎癥反應相關的促炎細胞因子的產生[29-34]。ARAMWIT等[29]研究發現,絲膠可以明顯減輕大鼠水腫模型的足部炎癥,其作用接近于抗炎藥吲哚美辛。逆轉錄聚合酶鏈反應結果顯示,在絲膠處理后,環氧化酶-2(COX-2)與誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因表達下調,且下調幅度依賴于絲膠濃度[29]。其中,COX-2是一種誘導型環氧化酶,其在細胞中的表達可通過炎癥刺激上調,進一步促進花生四烯酸生成前列腺素,從而提高促炎細胞因子的釋放,加重炎癥反應和組織損傷。iNOS僅在炎癥、外傷等病理條件下被誘導產生,促進合成大量的一氧化氮(NO),從而產生細胞毒性作用,加劇炎癥反應。由此可見,絲膠的抗炎特性可能與抑制COX-2及NO的產生相關。同樣地,KIM等[30]也發現,絲素蛋白在小鼠水腫模型中也表現出一定的抗炎活性,其抗炎能力與親免素衍生物PEP-1-FK506BP相當[31]。這可能與絲素蛋白可下調炎癥組織中COX-2、白介素(IL)-6、IL-1β及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達有關[32]。而當絲素蛋白與PEP-1-FK506BP聯用時可協同作用[33],其抗炎能力較單一組分更優。此外,核轉錄因子-κB(NF-κB)的過度激活也可能引起趨化因子、基質金屬蛋白酶、COX-2、iNOS的過度表達,從而使炎癥反應進一步加重[34]。根據SONG等[35]的研究結果,絲膠可以通過抑制NF-κB通路中幾種重要組分的磷酸化作用,從而抑制NF-κB通路及下調相關炎癥因子(如TNF-α、IL-18、趨化因子CCL2等)的表達。

2 具有抗炎功能的蠶絲基傷口敷料

利用絲素蛋白或絲膠蛋白可制備多種形式的傷口敷料,包括納米纖維[36]、水凝膠[37]、泡沫[38]、軟膏[39]及膜[40]等。由于蠶絲蛋白具有抗炎性質,因此蠶絲基敷料也表現出一定的抗炎能力[37]。如CHOUHAN等[41]發現,原位形成的絲素水凝膠敷料可以顯著下調促炎細胞因子TNF-α的表達,卻使抗炎標志物CD163表達增加,表明這種蠶絲基敷料可有效發揮蠶絲蛋白的抗炎作用,在一定程度上可達到治療傷口炎癥的目的。

單一的蠶絲基敷料并不能獲得較好的傷口炎癥治療效果[37,41]。因此,人們以蠶絲基敷料為載體,進一步將其他抗炎物質(如藥物[42]、生物提取物[37]、抗氧劑[43]等)與其復合,以期獲得優異的抗炎性能,如表1所示。

表1 各類抗炎蠶絲基傷口敷料的組成及功能Tab.1 Compositions and functions of different categories of anti-inflammatory silk-based wound dressings

2.1 蠶絲基納米纖維敷料

近年來,納米纖維因具有較大的比表面積、較高的孔隙率、優異的透氣性等優點而在傷口修復領域引起廣泛的關注[25,56-57]。目前,抗炎蠶絲基納米纖維傷口敷料大多以絲素蛋白為基質,利用靜電紡絲技術制備得到。例如,氟比洛芬作為一種非甾體抗炎藥,可以有效降低COX-2的活性,降低機體炎癥水平。因此,WEN等[42]通過同軸靜電紡絲技術制備了一種核殼納米纖維。這種納米纖維的殼層為聚氧乙烯,而芯層由絲素和膠原蛋白混合而成。為了滿足抗炎藥更快地釋放,選擇性地將氟比洛芬負載于親水的聚氧乙烯殼層;而通過將抗菌劑萬古霉素包埋于納米纖維的芯層,從而實現其緩慢釋放。這種雙功能納米纖維膜在發揮抗炎作用的基礎上,還具有抗菌功能,能有效避免因細菌感染而導致的炎癥加重,可以滿足傷口愈合的特定需求。然而,一般來說,非甾體類抗炎藥往往會導致脫靶;且高劑量的藥物也可能會造成嚴重的副作用[58]。因此,選用安全性更高的合成抗炎藥替代物添加到傷口敷料中,可在一定程度上解決副作用問題。

從動植物中獲得的生物提取物,如精油、酶、蜂蜜等,具有安全、便宜、環保等優點。此外,這些生物提取物通常具有固有的抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化特性[59]。因此,將這些生物提取物添加到蠶絲基傷口敷料中將賦予敷料更加優異的抗炎和促進傷口愈合功能。例如,青蒿素是一種從青蒿中提取的倍半萜內酯化合物,對活化的致病性T細胞具有選擇性,可作用于級聯反應中的多個免疫檢查點,對多種疾病具有協同治療作用[60]。因此,PENG等[36]采用靜電紡絲法制備了負載青蒿素的聚乳酸-羥基乙酸/絲素納米纖維膜(PLGA-SF-ART2)。由于絲素的存在,青蒿素表現出良好的緩釋效果,三周后的釋放量達到69%。大鼠體內實驗表明,PLGA/SF/ART2納米纖維膜可顯著下調促炎細胞因子IL-1β和TNF-α的表達,縮短全層傷口模型的炎癥周期,促進皮膚再生。蜂蜜作為一種古老的、具有藥理作用的營養物質,被廣泛作為傷口敷料添加劑。YANG等[48]以水作為溶劑,利用靜電紡絲方法開發了綠色環保、抗菌抗炎的麥盧卡蜂蜜/絲素/聚氧乙烯復合納米纖維膜。傷口修復實驗結果表明,絲素對于傷口的愈合具有一定的促進作用;而隨著麥盧卡蜂蜜的引入,復合納米纖維膜的促傷口愈合效果更加顯著,與商用的愛康膚銀敷料作用效果相當。

此外,當傷口處于持續的炎癥反應中時,中性粒細胞會產生大量的活性氧,從而對組織造成嚴重的氧化損傷。因此,利用抗氧化劑去除損傷部位過量的活性氧以減小其副作用,有利于減輕損傷部位的炎癥反應和促進傷口的愈合[61]。胡蘆巴是豆科植物中最古老的藥用植物之一,其種子具有潛在的抗氧化性質,可減小雙氧水對紅細胞的氧化損傷[62]。此外,其提取物也可用于增強生物材料的抗氧化性能,從而進一步加速傷口的愈合。基于此,SELVARAJ等[43]采用靜電紡絲方法制備了含有胡蘆巴提取物的絲素蛋白納米纖維(圖1(a)),并采用自由基捕獲劑2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)研究了納米纖維的抗氧化性能。結果表明,絲素納米纖維的清除比例為5.6%,而含葫蘆巴提取物(50%)的絲素納米纖維的清除比例達到49.3%。由此可見,絲素自身具有一定的抗氧化能力,而葫蘆巴的引入則使納米纖維的抗氧化能力大幅提高。傷口修復實驗結果表明,在第16天,未做處理和僅用絲素納米纖維處理的傷口愈合比例分別為87.0%和93.7%,而用含葫蘆巴提取物的絲素納米纖維處理的傷口已完全閉合(圖1(b)),并且顯示出最為有序的膠原沉積。盡管含生物提取物的抗炎蠶絲基納米纖維傷口敷料已被廣泛報道,且在促進傷口愈合方面顯示出巨大的潛力,但仍存在一些問題,如提取工藝復雜、生物活性不穩定及重復性較差等。

2.2 蠶絲基水凝膠敷料

水凝膠是一類具有三維網絡結構的含水聚合物材料,表現出與細胞外基質相似的特性。水凝膠可以為傷口提供濕潤的愈合環境,還具有透氣、吸收組織滲出物、自溶清創等優點[2]。目前,絲素蛋白已被廣泛用于制備抗炎蠶絲基水凝膠敷料。例如,YIN等[49]通過化學交聯的方式將具有抗菌、抗炎功能的大黃酸引入絲素蛋白水凝膠內,從而得到絲素/大黃酸復合水凝膠。這種復合水凝膠可以提高大黃酸的穩定性和結構完整性,因而在傷口修復實驗中,可更加顯著地降低傷口炎癥反應及預防細菌感染,并有效地重建新生血管和表皮。利用類似的方法,ZHANG等[12]將甘草酸引入到絲素蛋白水凝膠中。其中,甘草酸是一種從甘草根中提取的天然三萜,具有抗病毒、抗炎等藥理作用。此外,進一步通過引入銀以賦予水凝膠一定的抗菌性能。從組織切片中可以發現,用絲素/銀/甘草酸處理過的傷口只表現出輕微的炎性細胞浸潤現象,且在損傷發生后的第8天就已構建了較為完整的表皮和真皮。姜黃素是從姜黃中提取的一種生物分子,具有較強的抗炎和抗氧化能力,可用于預防癌癥和促進傷口愈合。為此,YU等[50]利用絲素、丙烯酰-β-環糊精及丙烯酸羥乙酯制備了一種基于主-客體作用和疏水β折疊雙重交聯的可注射水凝膠。利用β-環糊精的包合作用,可將姜黃素負載其中;且姜黃素初期不易爆釋,表現出長期、持續的藥物釋放行為。組織切片免疫熒光染色顯示,相比于商用的3M敷料,絲素蛋白水凝膠可明顯降低傷口組織處TNF-α的表達;而引入姜黃素后,這種作用更加顯著。此外,金屬基質蛋白酶的過量表達也會加重炎癥反應和組織損傷。因此,將可與鋅離子螯合的L-肌肽與姜黃素聯用,一方面可以利用姜黃素直接抑制炎癥反應發生;另一方面,L-肌肽可以奪取金屬基質蛋白酶活性中心的鋅離子,從而抑制金屬基質蛋白酶的生物活性,進一步減輕炎癥反應[51]。

圖1 絲素蛋白-葫蘆巴納米纖維的制備示意及不同時間點的傷口照片Fig.1 Schematic diagram for preparing of silk fibroin-fenugreek nanofibers and the photographs of wounds at different time points

除絲素蛋白以外,絲膠蛋白也可用于制備蠶絲基水凝膠敷料,如單一的絲膠組分[53]、絲膠/聚丙烯酰胺[63]、絲膠/聚谷氨酸[64]等。BAPTISTA-SILVA等[53]利用辣根過氧化物酶引發交聯,制備了一種絲膠基水凝膠敷料。這種水凝膠具有良好的透明性、吸水性、組織適應性及抗氧化性,可以顯著下調促炎細胞因子IL-6的表達,減少炎性細胞浸潤,并表現出促進細胞增殖和組織再生的能力(圖2)。

圖2 3M透明敷料(Tegaderm)或絲膠水凝膠處理的傷口照片Fig.2 Photographs of wounds treated with Tegaderm or sericin hydrogel

2.3 其他類型蠶絲基敷料

除了研究最多的納米纖維類和水凝膠類,抗炎蠶絲基傷口敷料還包括膜類[40]、泡沫類[38]及軟膏類[39]等。其中,膜類蠶絲基敷料可以通過澆筑法制備,一般具有較好的透明性,但透氣性相對較差。如BAI等[40]通過澆筑絲素蛋白和聚乙烯醇制備了一種透明復合膜,通過添加氯化鈉模板的方式,可以有效調控復合膜的孔隙率和透氣性。研究發現,這種復合膜具有一定的抗菌和抗炎功能;當添加適量茶樹油后,復合膜可以更加顯著地抑制脂多糖誘導的巨噬細胞產生NO,且抗菌比例明顯提高。WANG等[54]通過相同的方法制備了絲素蛋白膜,并基于絲素蛋白氨基酸序列上的多種活性基團與多巴胺的相互作用,獲得了多巴胺-絲素蛋白膜。實驗結果表明,相比于醫用紗布和絲素蛋白膜,多巴胺-絲素蛋白膜處理的傷口處表現出更加輕微的炎性細胞浸潤現象,且更早形成上皮組織。

泡沫類蠶絲基敷料一般可以通過冷凍干燥的方式制備,其優點在于具有多孔結構,因而可以吸收大量的組織滲出物及透氣性較好;此外,還能阻礙微生物的入侵。將脫膠后的絲素溶液與一定量的天麻萃取物、乙醇混合冷凍后,進行凍干,即可制備得到孔隙率約為40%～80%的絲素基泡沫敷料。這種泡沫敷料表現出天麻和絲素的聯合抗炎功能,其促進糖尿病傷口愈合的能力與商用的新霉素軟膏相當[38]。

軟膏是一類常見的用于促進傷口愈合的敷料形式,通常由基礎組分和功能組分組成。例如,NAGAI等[39]以卡波姆934為基礎組分,以曲尼斯特和絲素為功能組分制備了一種復合軟膏。其中,曲尼斯特是一種治療過敏性鼻炎、特應性皮炎、支氣管哮喘的有效藥物。實驗結果表明,含有曲尼斯特和絲素雙功能組分的復合軟膏可以提高糖尿病小鼠皮膚傷口的愈合率,并減少紅腫發生。ARAMWIT等[55]將絲膠與白凡士林、礦物油、羊毛脂、甘油、紅沒藥醇、尼泊金丙酯和尼泊金甲酯混合配制了絲膠軟膏,并發現該軟膏處理的傷口比分別經基礎軟膏和生理鹽水處理的傷口愈合更快,表明絲膠軟膏對于傷口的愈合是有利的。此外,從組織切片結果發現,絲膠軟膏處理的傷口組織中促炎細胞因子IL-1β和TNF-α的表達較其他實驗組明顯下降。

3 蠶絲基皮膚組織工程支架

盡管上述新型蠶絲基敷料在促進傷口修復方面表現出了巨大的潛力,但慢性傷口的有效愈合仍是醫療系統的一個重要挑戰[65]。因此,開發新的治療策略實現更高效地促進傷口愈合和提高患者的生活質量至關重要。在過去的十年中,基于組織工程和干細胞的研究為管理慢性傷口提供了新的方法[66]。WU等[67]通過兩步法制備了一種負載脂肪干細胞的絲素/殼聚糖復合皮膚組織工程支架(ADSC-SF/CS)。在第7天,相比于未做處理和經絲素/殼聚糖敷料處理的糖尿病大鼠傷口,用ADSC-SF/CS處理的傷口收縮幅度明顯更大,且炎癥反應較小、滲出液較少。而且從組織切片中可以看到(圖3),ADSC-SF/CS處理的傷口組織有較為粗大、成熟的毛細血管(箭頭所指),表明傷口愈合過程順利進行。

圖3 糖尿病大鼠的傷口及組織切片照片Fig.3 Photographs of the wounds and tissue sections of diabetic rats

羊膜是一種天然敷料,具有良好的彈性、抗菌性、抗炎性和較低的免疫原性,已在修復大面積皮膚潰瘍中顯示出良好的效果[68-69]。FARD等[70]、ARASTEH等[71]利用靜電紡絲技術,在羊膜基底側構建一層絲素納米纖維,并接種月經血源性間充質干細胞(MenSCs),得到新型的皮膚組織工程支架材料。這種支架可模擬體內皮膚天然細胞外基質的微觀結構,并促進MenSCs分化為角化細胞。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應和免疫染色技術可以判斷,新分化的MenSCs角化細胞在mRNA和蛋白水平上成功表達了角化細胞特異性標記物;而且,與傳統的二維培養系統相比,在皮膚組織工程支架上分化的細胞表達了更高水平的角化細胞特異性標記物。然而,從長遠角度考慮,這種支架材料仍存在一些問題。例如,同種異體移植的MenSCs的長期安全性和持續治療效果仍未可知;供體的差異可能影響MenSCs的免疫反應和分化能力。另外,羊膜作為這類皮膚組織工程支架的重要組成部分,其來源與處理方式可能對于最終的治療效果也會產生顯著的影響。

4 結 語

得益于蠶絲蛋白來源廣泛、安全、生物活性高等優點,抗炎蠶絲基敷料已在傷口修復領域顯示出巨大的潛力。相比于抗炎藥物和大部分生物提取物,蠶絲蛋白除了具有一定的抗炎功能外,還具有促進細胞黏附、增殖、遷移和分化的功能。此外,作為一種天然的大分子,蠶絲蛋白可制備成多種形式(如納米纖維、水凝膠、泡沫等)的敷料,這種敷料可作為載體負載抗炎物質,能有效地下調傷口組織處促炎細胞因子的表達,緩解炎癥反應,促進傷口愈合。此外,接種干細胞的蠶絲基皮膚組織工程支架利用干細胞強大的自我更新能力和分化能力,為創傷治療開辟了全新的研究方向。

在肯定抗炎癥蠶絲基敷料應用價值的同時,現存的問題及未來的發展方向也值得認真考慮。1) 傷口愈合是一個復雜的動態過程,除炎癥外,包括細菌感染、滲液等問題也會對其產生明顯的影響。因此,將抗菌、管理滲液等功能添加到抗炎癥蠶絲基敷料中,將使其更加符合實際的應用需求。2) 適當的炎癥促進傷口愈合,但過度的炎癥卻抑制其愈合。因此,賦予抗炎癥蠶絲基敷料一定的傳感功能,使其主動、自發地反饋實時的炎癥情況,使患者及醫護人員可以及時應對也非常必要。3) 由于蠶絲蛋白具有多種活性側基,因此與負載物有較強的相互作用,導致藥物的釋放緩慢持久。然而,根據炎癥的輕重程度,人們渴望藥物能夠表現出智能的釋放行為,以達到及時治療的目的。因此,通過合理的設計,將刺激響應性組分引入到抗炎癥蠶絲基敷料中,也將是其未來研究方向之一。

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