GeneXpert MTB/RIF檢測技術在基層結核病定點醫院的應用效果評價

陳家潔 陳孫云

結核病的病原學檢查是明確診斷結核病的重要方法。中華人民共和國國務院辦公廳發布了《“十三五”全國結核病防治規劃》，要求肺結核患者病原學陽性率要達到50%以上[1]。目前在臨床上使用的結核病的病原學檢測方法主要有：涂片鏡檢、培養、分子生物學檢測技術等。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(GeneXpert MTB/RIF，以下簡稱“GeneXpert檢測”)為基于熒光定量聚合酶鏈式反應技術(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，直接檢測標本中有無結核分枝桿菌感染及利福平耐藥基因[2]，逐漸在國內得到推廣。江陰市2017年尚未開展GeneXpert檢測技術，從2020年開始逐步推廣GeneXpert檢測技術，并于2020年底年實現了全市的檢測覆蓋。本文對江陰市2017年、2020-2021年活動性肺結核患者的病原學陽性率的差異進行分析，并對利福平耐藥患者的檢測進行評價，為該技術在基層結核病定點醫院大規模推廣提供借鑒經驗。

資料與方法

一、資料來源

病例資料來源于《中國疾病預防控制信息系統》的子系統《結核病信息管理系統》中江陰市2017年、2020年-2021年的結核病患者的登記數據。

二、患者納入與排除標準

納入標準：(1)肺結核診斷參照《WS 288—2017肺結核診斷》標準[3]，以病原學檢查為主，結合臨床癥狀和影像學進行綜合判斷，以病原學、病理學結果作為確診依據[4]；(2)本文的研究對象為活動性肺結核患者(包括病原學陽性和病原學陰性患者)；(3)所有患者經過臨床癥狀體征、影像學表現、免疫學檢查、病原學檢測及抗結核治療后療效觀察，最終確診為肺結核，均符合新的診斷標準[3]。排除標準：(1)病理學陽性肺結核；(2)結核性胸膜炎；(3)肺外結核；(4)肺炎、肺膿腫、非結核分枝桿菌肺病等患者。本研究經院倫理委員會審批([2021]倫審研第[065]號)。

三、患者納入情況

1 江陰市從2020年開始逐步推廣GeneXpert檢測技術，并于2020年底實現了全市的完全檢測覆蓋，檢測對象范圍擴大至所有的疑似肺結核患者。江陰市在2018-2019年在所有涂陰肺結核患者中開展環介導等溫擴增技術(LAMP技術)檢測，故2018-2019年的數據不納入本研究中。

2 2017年和2020-2021年江陰市登記的肺結核患者總數為1434例，其中結核性胸膜炎患者118例，病理學陽性患者62例，故納入本文中的活動性肺結核患者總數為1254例，其中男904例，女350例，男女比例為2.58：1，年齡13～85歲，平均(49.3±19.1)歲。

四、相關定義

1 病原學陽性包括涂片陽性、僅培養陽性、僅分子生物學陽性[5]。

2 病原學陰性是指涂片、培養、分子生物學檢測均陰性[4]。

3 僅培養陽性：分枝桿菌培養陽性且菌種鑒定為結核分枝桿菌復合群，但涂陰GeneXpert陰性或GeneXpert 未檢測的患者[6]。

4 僅分子生物學陽性(本文指僅GeneXpert陽性)：GeneXpert檢測到結核分枝桿菌核酸，但涂陰培陰或培養未檢測的患者[6]。

5 病原學陽性率是指某年登記的活動性肺結核患者中，病原學陽性患者所占比例[6]。病原學陽性率(%)=(涂片陽性+僅培養陽性+僅GeneXpert陽性)患者例數/活動性肺結核患者例數(病原學陽性患者和病原學陰性患者)×100%[5]。

五、檢測方法

1 痰標本采集

患者(包括門診和住院患者)深呼吸后咳出痰液，用痰液收集瓶收集3～5mL痰標本(可多次留取)。建議清晨清水漱口后，留取支氣管深部的痰液，避免留取唾液。

2 支氣管鏡檢查

患者使用Olympus BF260或者BF290電子支氣管鏡進行檢查，根據影像學選擇病變部位的支氣管進行灌洗，灌入40～60mL生理鹽水，負壓吸引回收灌洗液至無菌容器。同一份BALF標本行涂片和GeneXpert檢測。

3 涂片抗酸染色法

采用萋-尼抗酸染色，按照《結核病實驗室檢驗規程》[7]進行痰或者肺泡灌洗液涂片抗酸染色，首先用抗酸染色全自動顯微掃描系統(杭州上池科技有限公司提供，型號：MSS-TB-01)進行掃描(每張待檢玻片設定3300個連續視野進行掃描)，技術人員再對系統軟件提示為陽性的玻片進行人工鏡檢復核后判讀結果。同一例3份完成涂片的標本中，任何一份發現抗酸桿菌即判定為涂片陽性。

4 GeneXpert檢測

取合格痰標本或者肺泡灌洗液標本1 mL,加入2mL標本處理液,震蕩混勻后,靜置15min，取2mL 液化標本加入 Xpert MTB/RIF 試劑盒(美國 Cepheid 公司),置于檢測模塊,儀器自動運行檢測,2h后由系統自動判讀 MTB 檢測結果[8]。

5 痰培養

按照國家標準進行檢測(Bacth960培養基)。2017年、2020-2021年，因我市未常規開展痰培養檢測技術，是將痰標本送至上級傳染病醫院(無錫市第五人民醫院)進行檢測。

六、統計學處理

采用 SPSS 21.0 軟件對數據進行統計學分析，計數資料以“率(%)”表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P<0.01為差異有統計學意義。

結 果

一、病原學檢測的送檢情況(具體見表1)

表1 2017年和2020-2021年江陰市活動性肺結核患者的病原學送檢情況[n(%)]

2017年501例患者行痰涂片檢測。80例患者行痰培養檢測，陽性38例(痰涂陰培陽11例、痰涂陰培陰40例、痰涂陽培陽27例、痰涂陽培陰2例)。

2020年404例患者行涂片檢測。328例患者行GeneXpert檢測。有6例痰涂陰患者行痰培養檢測，陽性1例。有26例患者行支氣管鏡檢查：肺泡灌洗液涂片檢測26例，陽性9例；肺泡灌洗液GeneXpert檢測13例，陽性12例(BALF涂陰GeneXpert陽性11例、BALF涂陽GeneXpert陽性1例、BALF涂陰GeneXpert陰性1例)。

2021年349例患者均行涂片和GeneXpert檢測。有18例痰涂陰患者行痰培養檢測，陽性4例。有46例患者行支氣管鏡檢查：肺泡灌洗液涂片檢測46例，陽性17例；肺泡灌洗液GeneXpert檢測39例，陽性35例(BALF涂陰GeneXpert陽性24例、BALF涂陽GeneXpert陽性11例、BALF涂陰GeneXpert陰性3例、BALF涂陽GeneXpert陰性1例)。

二、病原學陽性率

2017年、2020年及2021年江陰市活動性肺結核患者的病原學陽性率分別為44.31%(222/501)、68.56%(277/404)和74.50%(260/349)，差異有統計學意義(χ2=94.576，P<0.001)。2020年我市全面推廣GeneXpert檢測技術后，2020-2021年我市活動性肺結核患者的病原學陽性率為71.31%(537/753)，明顯高于2017年的44.31%(222/501)，差異有統計學意義(χ2=91.816，P<0.001)。具體(見表2)。

表2 2017年和2020-2021年江陰市活動性肺結核患者的病原學檢測結果

三、涂陰患者的GeneXpert檢測情況

2020-2021年在涂陰活動性肺結核患者中共有135例患者通過GeneXpert檢測出陽性，在涂陰活動性肺結核患者中GeneXpert檢測陽性率從36.03%(49/136)上升至48.04%(86/179)。具體(見表 3)。

表3 2020-2021年江陰市涂陰肺結核患者的GeneXpert檢測情況

四、涂陽患者的GeneXpert檢測情況

2020年在227例涂陽活動性肺結核患者中，有192例進行了GeneXpert檢測，檢測出123例陽性，檢測陽性率為64.06%(123/192)，其中發現9例利福平耐藥患者。2021年170例涂陽活動性肺結核患者均進行了GeneXpert檢測，檢出108例陽性，檢測陽性率為63.53%(108/170)，其中發現5例利福平耐藥患者。2020-2021年，對GeneXpert在涂陽活動性肺結核患者中的檢測陽性率進行比較，差異無統計學意義(χ2=2.1524，P=0.1423)。具體(見表4)。

表4 2020-2021年江陰市涂陽肺結核患者的GeneXpert檢測情況

五、活動性肺結核患者的GeneXpert檢測情況

2020年在活動性肺結核患者中，有328例進行了GeneXpert檢測，檢測出172例陽性，檢測陽性率為52.44%(172/328)。2021年349例活動性肺結核患者進行了GeneXpert檢測，檢出194例陽性，檢測陽性率為55.59%(194/349)。具體(見表5)。

表5 2020-2021年江陰市活動性肺結核患者的GeneXpert檢測情況

六、利福平耐藥患者的檢測

2017年痰培養檢測發現利福平耐藥患者11例(在痰涂陰培陽患者中發現1例、在痰涂陽培陽患者中發現10例)，2020-2021年GeneXpert檢測發現利福平耐藥患者16例。在涂陰活動性肺結核患者中，2020-2021年GeneXpert檢測出2例利福平耐藥患者。

討 論

2017年的肺結核診斷標準《WS 288—2017肺結核診斷》[3]將結核病分子生物學檢測納進結核病的病原學檢查范疇。痰涂片法簡單快捷，成本低，易普及，是國內最普遍使用的結核病檢測方法[9]，但痰涂片陽性檢出率低。GeneXpert檢測技術是利用半巢式實時熒光PCR技術，以rpoB基因為靶基因，提取DNA 后擴增 rpoB 基因 192bp片段進行檢測，并用rpoB 基因 81bp 利福平耐藥核心區設計引物、探針，5個相互重疊分子探針檢測利福平耐藥[10]。

因本研究中患者總數已剔除病理學陽性患者的人數(2017年病理學陽性25例，2020年病理學陽性19例，2021年病理學陽性18例)故本文中涂片陽性率略高于冒小歐等[11]的研究結果。將病理學陽性人數納入患者總數中，計算2017年、2020年、2021年的涂片陽性率分別為40.11%(211/526)、53.66%(277/423)、46.32%(170/367)。我市2017年的涂片陽性率與李國莉[5]等的39.15%研究結果相近。

低質量、不一致的痰涂片染色技術，標本碎屑，人眼視覺的變異和疲勞等因素會導致傳統顯微鏡人工閱片來檢測痰涂片的靈敏度低至40%[12]。使用基于人工智能計算機輔助診斷技術的自動顯微鏡系統對結核病進行自動診斷，可以提高其抗酸桿菌檢出率、提高工作效率[13]。丁北川等[14]研究表明：抗酸染色全自動顯微掃描系統檢測痰涂片陽性率(43.22%)明顯高于傳統抗酸桿菌染色鏡檢(38.24%)，并且對于低陽性級別痰標本，全自動顯微掃描系統具有一定的優勢。將病理學陽性人數納入患者總數中，計算2020-2021年江陰市的涂片陽性率為50.25%(397/790)。自我市2020年引進抗酸染色全自動顯微掃描系統后，我市涂片陽性率較前明顯提高。

2017年我市肺結核病原學診斷的主要方法是痰涂片和痰培養。相較于傳統的肺結核病原學診斷技術，分子生物學檢測能明顯提高肺結核病原學方面診斷的準確性。江陰市2018-2019年在所有涂陰肺結核患者中開展環介導等溫擴增技術(LAMP技術)檢測。冒小歐等[11]研究表明：江陰市充分利用分子生物學檢測技術，極大地提高了病原學診斷陽性率，2018-2019年病原學診斷陽性率達到54.22%。從病原學陽性率數據來看，我市的肺結核病原學陽性率從2017年的44.31%顯著提升至2021年的74.50%，其主要的原因是在于GeneXpert檢測技術在江陰市得到全面推廣應用。《江蘇省“十四五”結核病防治規劃》，要求肺結核患者病原學陽性率要達到62%以上[15]，2020-2021年江陰市主要通過涂片和GeneXpert檢測技術應用，我市肺結核患者病原學陽性率已經達到上述要求。

對所有涂陰肺結核患者進行GeneXpert檢測，能有效提高病原學陽性率。2020-2021年江陰市在涂陰活動性肺結核患者中共有135例患者通過GeneXpert檢測出陽性。在涂陰活動性肺結核患者中GeneXpert檢測陽性率從36.03%(49/136)上升至48.04%(86/179)。本研究中，GeneXpert在涂陰活動性肺結核患者中的檢測陽性率與王蔚等[16]的研究結果相近。說明涂陰肺結核患者在涂片鏡檢后有必要補充做GeneXpert檢測。

2020年和2021年，江陰市在涂陽活動性肺結核患者中GeneXpert的檢測陽性率分別為64.06%(123/192)、63.53%(108/170)，比文獻報道[10]的略低，分析原因可能是(1)本研究中每位患者用痰液收集瓶收集3～5mL痰標本(可多次留取)，未用同一份痰標本同時進行涂片及GeneXpert檢測，而是同一位患者的兩份痰標本分開進行檢測，可能與痰標本的質量有關系，這也是本研究需要改進的地方；(2)患者留取痰標本的時間不同，有些患者是同一時間留取2～3份痰標本，有些患者是多次留痰，痰GeneXpert檢測時間有滯后性：先留取痰標本進行痰涂片檢測，在痰涂片結果出來后，再留取痰標本進行GeneXpert檢測，可能第一次的痰涂片標本質量更高；(3)本研究中進行支氣管鏡檢查的患者，留取肺泡灌洗液標本，采用同一標本進行涂片和GeneXpert檢測，涂片與GeneXpert檢測結果一致率達90%以上，提示標本采集送檢一致性可提高GeneXpert陽性率；(4)可能與GeneXpert檢測方法的檢測閾值有關。

2020年和2021年，江陰市在活動性肺結核患者中GeneXpert的檢測陽性率分別為52.44%(172/328)、55.59%(194/349)，比文獻報道[17]的GeneXpert檢測陽性率39.17%略高，可能是：文獻中采用的檢測樣本均為痰標本，本文中的檢測樣本除痰液外，還包括支氣管鏡肺泡灌洗液。臨床中有一部分患者自主咳出痰液較少，也有少部分患者無咳痰。支氣管鏡檢查是無法自主排痰患者必不可少的檢查手段[18]。虞忻等[19]的研究結果顯示：支氣管鏡BALF Xpert陽性率57%明顯高于痰Xpert陽性率32.3%。所以在基層結核病定點醫院，在沒有支氣管鏡檢查禁忌癥的情況下，應盡量提高疑似肺結核患者的支氣管鏡檢查率，尤其是無咳痰的患者。

結核病的早期診斷及其耐藥性的檢測，對于很好地控制耐藥結核病的傳播具有十分重要的意義[20]。傳統的痰培養檢測，需要6～8周的時間才能得到結果，而通過 GeneXpert 檢測技術的使用，能顯著縮短診斷肺結核所需時間(可在2小時內得到結果)，同時可以快速檢測利福平耐藥性，早期制定耐藥治療方案。2017年我市通過痰培養檢測發現利福平耐藥患者11例。2020-2021年我市未在痰培養檢測中發現利福平耐藥患者，通過GeneXpert檢測發現利福平耐藥患者共有16例，并在涂陰活動性肺結核患者中檢測出2例利福平耐藥患者。《江蘇省“十四五”結核病防治規劃》[15]，要求結核病定點診療機構全部開展分子診斷耐藥篩查，縮短診斷時間，對所有疑似肺結核患者進行耐藥篩查，最大限度發現耐藥結核病患者。自2020年我市引進GeneXpert檢測技術后，首先用GeneXpert檢測技術對所有疑似肺結核患者進行利福平耐藥的初步篩查，如果兩次GeneXpert檢測(間隔時間24小時以上)發現利福平耐藥均陽性，隨即將上述患者轉至上級傳染病醫院(無錫市第五人民醫院)，極大地縮短了利福平耐藥患者的檢測時間。

綜上所述，通過在我市全面推廣使用GeneXpert檢測技術，大大提高了基層醫院活動性肺結核患者病原學陽性率，并能及早發現結核感染和利福平耐藥患者，從而盡早制定治療方案。該檢測技術僅需簡單培訓即可掌握，只需極少的生物安全設施，不易發生交叉污染。特別是對于尚未開展痰培養檢測技術的基層醫院，可開展分子診斷耐藥篩查，用GeneXpert檢測技術作為替代，對所有疑似肺結核患者進行利福平耐藥的初步篩查。GeneXpert檢測技術非常適合在基層結核病定點醫院大規模推廣。