鼻咽癌組織STR基因座變異的研究

馬棟棋，楊慧凌，孟潔敏，王韻，徐冬冬,3，杜冰,3

(川北醫學院基礎醫學與法醫學院,1.組織學與胚胎學教研室；2.法醫物證教研室；3.川北醫學院司法鑒定中心，四川 南充 637000)

短串聯重復序列(short tandem repeats，STR)又稱微衛星DNA，是由2～6個核苷酸組成的簡單串聯排列的DNA序列，在人群中呈高度多態性，遵循孟德爾遺傳規律，具有較強的遺傳穩定性。但是，在腫瘤組織中，由于基因組的突變，STR變異的發生率顯著高于正常組織。腫瘤組織STR基因座的異常分型主要包括4類[1]，即等位基因增加(additional allele，Aadd)、新等位基因(new allele，Anew)、完全雜合性丟失(complete lost of heterozygosity，LOH)和部分雜合性丟失(partial lost of heterozygosity，pLOH)。多項研究[2-10]表明腫瘤組織中存在STR變異，因此，在腫瘤組織中，采用STR基因座進行個體同一認定時，不能完全照搬以往的評價體系作出肯定或排除的評判結果。

鼻咽癌作為頭頸部惡性腫瘤，發病率高，是四川、廣東等地區常見的惡性腫瘤之一。本研究選取四川東北地區鼻咽癌組織作為研究對象，采用21個常染色體STR基因座及Amel基因座分型檢測，旨在發現鼻咽癌組織中法醫學常用STR基因座的變異類型及變異規律。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年9月至2017年8月川北醫學院附屬醫院收治的79例經病理學診斷確診為鼻咽癌患者的腫瘤組織及其對照組織。本研究經倫理委員會批準，患者均知情同意?；颊叩哪[瘤組織來源于病理科石蠟包埋組織，對照組織為同一個體的外周靜脈血。鼻咽癌患者中有61例收集到臨床病理資料，包括患者的性別、年齡、臨床分期等，其中男性42例，女性19例，年齡20～80歲，服從正態分布，平均年齡50歲?；颊吲R床分期為Ⅰ～Ⅳ期(2008廣州分期[11])，其中Ⅰ期1例，Ⅱ期5例，Ⅲ期31例，Ⅳ期24例。

1.2 DNA提取

腫瘤組織基因組DNA提?。翰捎肨IANamp FFPE DNA Kit試劑盒提取石蠟切片組織樣本基因組DNA，操作步驟按說明書進行。

對照組織基因組DNA提?。翰捎肅helex-100法提取外周靜脈血樣本基因組DNA，按常規操作步驟進行。

1.3 擴增及電泳

采用AGCU Expressmarker 22復合擴增系統(D2S441、D2S1338、vWA、D3S1358、PentaE、D5S818、D6S1043、TPOX、D7S820、D8S1179、TH01、D10S1248、D12S391、CSF1PO、D13S317、PentaD、D16S539、D18S51、FGA、D19S433、D21S11和Amel性別基因座)對樣本DNA進行復合擴增。反應體系10 μL，含模板DNA 2 μL，Reaction Mix 4 μL，EX22 Primers 2 μL，熱啟動C-Taq酶0.4 μL，sdH2O 1.6 μL。反應體系經95 ℃變性2 min，以94 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s循環10次，再以90 ℃ 30 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s循環18次，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經AB 3500 Genetic Analyzer電泳分型，GeneMapper ID-X軟件分析圖譜，統計分型結果。

對比同一個體腫瘤組織及其對照組織的STR分型結果，觀察鼻咽癌組織STR基因座等位基因的變異情況，出現變異的樣本再重復檢驗1次進行確認。其中，部分雜合性丟失的評判標準以等位基因的峰高或峰面積的比值<0.5或>2.0為準[12]。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計數資料采用[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料以頻數表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織個體變異統計

通過比較鼻咽癌組織和對照組織的分型結果，79例鼻咽癌組織中有26例發生了STR變異，發生率為32.9%。其中有5例鼻咽癌組織發生Aadd，1例出現Anew，5例發生LOH，25例發生pLOH。其中，Aadd、Anew、LOH等三種變異可導致STR基因型改變[13](STR genotype alteration，STRGA)，本研究鼻咽癌組織STRGA的發生率為8.9%。同一個體可同時發生多種類型STR變異。見表1。

表1 鼻咽癌組織STR變異類型的發生率

2.2 鼻咽癌組織STR基因座變異統計

經21個常染色體STR基因座及Amel基因座的分型檢測，鼻咽癌組織中有19個STR位點發生了變異。其中，Penta E、D2S441、TPOX、D2S1338、Penta D、D10S1248、D5S818等7個位點只發生了pLOH，未引起基因型改變。D3S1358、D13S317、D16S539、TH01、CSF1PO、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D12S391、FGA等12個STR基因座的變異導致基因型發生了改變。出現變異次數最多的基因座是D3S1358，共發生了12次變異，包括兩次LOH和10次pLOH。D7S820、D19S433和Amel基因座未發生變異。同一個體多個基因座可同時發生變異。見表2。

表2 79例鼻咽癌組織中等位基因變異統計

續表2

2.3 鼻咽癌組織STR變異在性別、年齡、臨床分期的分布

61例鼻咽癌患者臨床病理資料中，STR變異在性別、年齡、臨床分期的分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)，即鼻咽癌組織STR變異與患者的性別、年齡、臨床分期等資料無明顯相關性。見表3。

表3 鼻咽癌STR變異結合臨床資料的分析[n(%)]

2.4 STR變異圖譜示例

STR變異圖譜示例見圖1-圖4。

3 討論

現代腫瘤學說中，癌癥是在分子水平出現多次的遺傳學改變，腫瘤組織STR變異是遺傳不穩定性的體現。本研究發現，鼻咽癌組織STR變異的發生率為32.9%。變異類型包括Aadd、Anew、LOH、pLOH，其發生率分別是6.3%、1.3%、6.3%、31.6%。其中，Aadd 、Anew 、LOH等三種變異會導致基因型發生改變，對DNA鑒定結果產生影響。此外，本研究中鼻咽癌組織STRGA發生率是8.9%，因此涉及該類腫瘤組織的DNA檢案鑒定，出現個別位點基因型不匹配時，宜慎重下排除結論。不同腫瘤組織中STR變異存在差別。Li等[14]在結直腸癌組織中發現STR變異的發生率分別是Aadd 0.89%、Anew 0.57%、LOH 0.89%、pLOH 8.93%；李璐等[15]報道甲狀腺乳頭狀癌組織中STR變異的發生率分別是Aadd 0.11%、Anew 0.74%、LOH 0.32%、pLOH 1.17%；Zhang等[16]在肺癌組織中發現3種變異類型，其發生率分別是Aadd 13.3%、LOH 13.3%、pLOH 46.7%。腫瘤組織中Aadd、Anew的發生率較低，pLOH發生率較高，這可能與它們的發生機制不同有關。另外，肺癌組織STR變異發生率較高，鼻咽癌STR變異發生率次之，結直腸癌、甲狀腺乳頭狀癌組織STR變異發生率較低，提示不同腫瘤組織的基因組穩定性可能存在差異。

本研究選取的22個STR位點有19個發生了變異，其中變異次數最多的STR基因座是D3S1358，與既往研究[17-18]結論一致，鐘巧娥等[17]在人肺癌組織STR變異的研究中發現，變異次數最多的基因座是D3S1358和CSF1PO；Poetsch等[18]在四種不同類型腫瘤中發現，D3S1358、D21S11、D18S51和FGA基因座表現了較高變異率。D3S1358的變異率較其它位點高，提示D3S1358在腫瘤組織中穩定性較差，不適合用于腫瘤組織的個體識別及親權鑒定。張相國等[19]對廣東地區鼻咽癌組織的分型檢測中發現，D18S51和D16S539等2個基因座發生了微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)，MSI的發生率為7.3%。本研究D18S51、D21S11、CSF1PO、D6S1043、D8S1179等5個位點發生了MSI，MSI的發生率為7.6%，且D16S539基因座的變異類型是LOH和pLOH，這與張相國等[19]的報道不同。分析原因可能是與研究對象的地域、遺傳背景、樣本數量、選用的STR位點等不同有關。本研究中，D7S820、D19S433和Amel基因座未發生變異，提示其在鼻咽癌組織中的穩定性較好，后續可擴大腫瘤樣本量及樣本類型，探究其在腫瘤組織DNA鑒定中的應用價值。

另外，本研究檢測用的STR位點有19個均發生了變異，且STR變異與鼻咽癌患者的性別、年齡、臨床分期等無明顯相關性，與既往研究基本一致。張相國等[20]研究MSI與鼻咽癌的臨床相關性時也發現，鼻咽癌MSI的發生與患者性別、年齡、臨床分期等無顯著相關性。然而，Zhang等[16]、馬若翔等[21]在肺癌組織中的研究報道稱，STR變異與患者的年齡及肺癌的分期有關，年齡越大，進展期越深的患者變異頻率越高。Zhen等[22]對甲狀腺乳頭狀癌的研究發現，STR變異與患者的性別無關，但與患者的年齡有顯著的相關性。因此，盡管此類STR位點處于非編碼區，但在某些腫瘤組織中其變異仍然可能與疾病存在關系，具有一定的臨床探究價值。

綜上，鼻咽癌組織中STR基因座變異與患者性別、年齡、臨床分期等無明顯相關性。鼻咽癌組織中D3S1358基因座的變異率高，而D7S820、D19S433和Amel基因座未發生變異。