細胞外泌體蛋白AGR2表達差異與上皮性卵巢癌獲得性耐藥關系及機制研究

曹陽，謝鑫，李明珠

(1.中國醫科大學腫瘤醫院·遼寧省腫瘤醫院；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110042)

卵巢癌是世界上第七大常見癌癥，也是繼乳腺癌和宮頸癌之后女性第三大常見癌癥[1-2]。雖然部分國家卵巢癌的死亡率呈下降趨勢，但是近20年全球總體5年生存率無明顯變化[3-4]，我國卵巢癌患者5年生存率約為30%[1-2]。經過專業對癥治療，70%的一線治療達到完全緩解的卵巢癌患者3年內仍會復發，且隨著治療次數的增多，多藥耐藥等副作用也隨之出現，導致患者緩解期或穩定期越來越短，最終導致死亡[5]。治療中出現的獲得性耐藥與遺傳突變、細胞凋亡切斷、腫瘤增強修復和免疫系統抑制密切相關[6]。目前，細胞減滅術結合化療已成為卵巢癌標準治療方法，最初一線藥物化療的有效率高達65～80%，但約50%的患者最終產生耐藥[7]。目前，鉑耐藥是主要的卵巢癌治療障礙。

外泌體為一類直徑30～150 nm的脂質雙層小膜泡，人體內幾乎所有細胞都能產生外泌體，包括腫瘤細胞。分泌細胞將外泌體分泌到內環境中被受體細胞接受，從而影響受體細胞的生物學行為。前梯度蛋白 2 (recombinant anterior gradient protein 2，AGR2)是一種細胞外泌性蛋白[8-9]，在多種癌癥中呈高表達，可能與增強癌細胞的適應性有關[10]。既往研究已驗證了AGR2 在癌癥環境中的存在，但有關外泌體中的AGR2報道較少。本研究擬探討AGR2表達水平對上皮性卵巢癌獲得性耐藥性的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Dulbecco改良鷹培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(Hyclone)；其他細胞培養所需基本試劑(北京索萊寶科技有限公司)、PCR試劑盒與Western blot試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。大鼠卵巢癌細胞NUTU-19購自上海滬崢。

1.2 實驗儀器

紫外分光光度計(T6新世紀)、恒溫干燥干箱、Real-time PCR儀(Bio-Rad)、光學顯微鏡(奧林帕斯)、細胞培養箱(Thermo)、高速冷凍離心機(長沙湘儀，型號TGL-20M)、制冰機(日本三洋，型號SIM-F140)、轉膜儀(Bio-Rad)等。

1.3 卵巢癌細胞的培養

NUTU-19細胞維持培養基為含10%胎牛血清的洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培養基環境，待細胞密度為80%～90%，去除原有培養基，無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3～5次，并加入胰酶消化，使細胞呈單細胞懸液，再加入10%胎牛血清+90%含1.5 g/L NaHCO3的DMEM培養基，移至細胞培養箱(氣相：95%空氣，5%CO2,37 ℃)中培養。細胞貼壁生長，上皮細胞樣(鼠卵巢癌細胞)，1∶3傳代，2～3 d換培養液1次(半量換液)。

1.4 耐藥細胞株篩選與鑒定

耐藥細胞株的造模過程：通過6、12、18、24 μg/mL遞進式順鉑藥物濃度加入到細胞培養基中，每次更高梯次濃度給藥均要求于上一梯次藥物濃度環境下細胞增殖平穩后再進行，順鉑濃度到達24 μg/mL就不再變化，持續同一濃度給藥，培養細胞的耐藥性。將篩選出的耐藥細胞株(NUTU-19R)停止加入順鉑兩個細胞培養周期(約1周)再進行后續試驗，規避化療藥物干擾相關實驗結果。MTT法檢測細胞的生存率：NUTU-19細胞和耐藥細胞株(NUTU-19R)以5×103個細胞/孔加樣于96孔培養板內，培養基100 μL含有梯度濃度順鉑，培養60 h，酶聯免疫儀檢測490 nm波長處吸光度值(OD值)，勾畫生存率曲線并分析。

1.5 外泌體提取和鑒定

細胞繼續培養 72 h獲得上清夜，采取差速離心法獲得外泌體，300 r/min 、4 ℃離心10 min，獲得上清液；2 000 r/min 、4 ℃離心10 min，取上清繼續10 000 r/min、4 ℃離心30 min，獲得上清液，濾掉細胞碎片和大體積囊泡；100 000 r/min 離心 30 min，獲沉淀物，無菌PBS液沖洗，再次100 000 r/min、4 ℃離心90 min，獲沉淀以50 μL無菌 PBS重懸。納米流式法檢測外泌體的粒徑大小及顆粒濃度。

1.6 實驗指標

1.6.1 反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測細胞AGR2相關mRNA轉錄情況 細胞經處理后，清除培養基，把細胞放在冰面上，預冷消毒后的PBS液清洗3遍。經總RNA提取、變性、復性、延伸、電泳、拍照等步驟完成PCR實驗。AGR2引物序列：F5′-GTCAGCATTCTTGCTCCTTGT-3′；R5′-GGGTCGAGA GTCCTTTGTGTC-3′。

1.6.2 Western blot法檢測細胞外泌體AGR2 蛋白表達情況 收集的外泌體經預冷消毒后的PBS處理后，經裂解、電泳、轉膜、一抗孵育、二抗孵育、蛋白檢測等步驟完成Western blot實驗。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 耐藥細胞株的篩選和鑒定

隨著給藥濃度的增加，細胞的密度逐漸降低，當藥物濃度達到24 μg/mL并穩定一段時間，細胞密度也趨于穩定，此時得到NUTU-19R。NUTU-19細胞經過化療藥濃度的提高，其生存率降低，趨勢清晰可見，即腫瘤細胞生存率與化療藥濃度之間關系呈負相關； 但NUTU-19R在化療藥物濃度上升中生存率曲線沒有較大的波動，即藥物濃度的升高與細胞死亡率無相關性，表明細胞對藥物敏感性較差，對化療藥可能存在耐藥性。NUTU-19R的OD值為(0.52±0.15)，高于NUTU-19的OD值為(0.38±0.05)(t=3.936，P<0.05)。見圖1及表1。

表1 NUTU-19與NUTU-19R細胞株OD值

DDP(μg/mL)010204060100NUTU-190.62±0.050.45±0.020.38±0.020.32±0.060.30±0.010.19±0.05NUTU-19R0.53±0.040.53±0.070.51±0.060.56±0.010.54±0.020.41±0.06

2.2 NUTU-19R細胞株和NUTU-19細胞株細胞AGR2相關mRNA轉錄情況對比

NUTU-19R細胞株細胞AGR2的mRNA為(0.76±0.09)，高于NUTU-19細胞株細胞AGR2的mRNA為(0.52±0.08)，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2及表2。

2.3 NUTU-19R細胞株和NUTU-19細胞株細胞AGR2 蛋白表達水平對比

NUTU-19R細胞株細胞AGR2 蛋白表達相對水平為(0.63±0.06)，高于NUTU-19細胞株細胞AGR2 蛋白表達水平為(0.51±0.09)，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2及圖3。

表2 NUTU-19與NUTU-19R細胞株AGR2相關mRNA轉錄和蛋白表達情況對比

3 討論

卵巢癌是女性最致命的癌癥之一，化療仍是常見的有效治療方法，但部分卵巢癌細胞對化療藥物產生耐藥性，導致臨床常規藥物失效。外泌體參與的細胞間信息傳遞有三種形式：一種為外泌體膜蛋白能夠和受體細胞膜結合并介導受體細胞信號通路；第二種為細胞外環境中蛋白酶將外泌體膜蛋白剪切，蛋白短鏈以配體形式和細胞膜受體結合并介導信號通路；第三種外泌體膜能夠和受體細胞膜類似于細胞內吞形式結合，無差別吞入內容物[11]。外泌體發揮的作用決定于其釋放物種類，AGR2最初在乳腺癌細胞中被發現[12]。AGR2定位于不同的細胞室，如細胞質，漿膜和細胞外環境[8]。近年來，越來越多的研究證實了AGR2存在于細胞外環境中，特別是在癌癥內環境中[13]。

AGR2可在多種實體腫瘤中表達，如AGR2可促進膀胱癌的發生、發展，檢測膀胱癌組織AGR2表達有助于判斷膀胱癌患者病情及評估預后[14]；AGR2通過上調CCAAT增強子結合蛋白β和轉錄因子缺氧誘導因子2α亞基的表達，從而影響細胞信號傳導和代謝，在腎透明細胞癌進展中發揮重要作用[15]。本研究發現耐藥細胞株細胞對藥物不敏感，更易對藥物產生耐受性，卵巢癌細胞在出現鉑類耐藥后，AGR2相關mRNA轉錄增多，蛋白表達上調。綜上，AGR2的表達與上皮性卵巢癌獲得性耐藥性密切相關，細胞外泌體蛋白AGR2高表達促進了上皮性卵巢癌獲得性耐藥的形成。