N-甲基-N” -硝基-N-亞硝基胍復合法構建胃癌前病變氣虛血瘀證大鼠模型

左嬌嬌 ，舒勁 ，宋瑞平 ，陳心怡 ，封壯壯

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，居全球癌癥相關性死亡原因第3位[1]。全球每年約有120萬新發(fā)胃癌病例，其中約40%發(fā)生在中國[2]。1971年世界衛(wèi)生組織提出，異型增生為直接的“胃癌前病變”[3]。廣義的胃癌前病變（precancerous lesion of gastric cancer，PLGC）包括腸上皮化生及異型增生。Correa等[4]指出，胃癌的發(fā)生模式為正常胃黏膜→非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃腺癌（腸型），至今仍被廣泛認可。鑒于PLGC是胃癌發(fā)病風險增加的重要病理階段，也是預防胃癌發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。因此，早期有效阻斷或逆轉PLGC向胃癌轉變對胃癌防治具有重要意義。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學對PLGC缺乏有效的干預措施，中醫(yī)藥在防治PLGC方面具有一定優(yōu)勢[5]。動物實驗是研究PLGC發(fā)病機制及藥物療效的重要途徑，故建立合理有效、安全穩(wěn)定的病證結合動物模型尤為重要。大鼠因易于飼養(yǎng)、成模率高的特性，成為PLGC模型制備最常用的實驗動物[6]。N-甲基-N” -硝基-N-亞硝基胍（MNNG）法是目前較公認的PLGC造模方法[7-9]。該法主要模擬人類過多攝入硝酸鹽后，在胃內轉化為亞硝酸銨等致癌物質，誘導胃黏膜組織發(fā)生慢性萎縮性胃炎及PLGC等病理損傷過程[10]。本課題組對MNNG誘導的模型進行改良，采用MNNG復合造模法（MNNG溶液自由飲用+饑飽失常+乙醇灌胃+氨水自由飲用+雷尼替丁飼料喂養(yǎng)）構建病證結合PLGC大鼠模型，動態(tài)觀察并記錄大鼠表征變化，結合大鼠體質量、24 h進食量、24 h飲水量及胃黏膜病理形態(tài)等指標綜合評價，判斷其證候，為建立理想、安全、穩(wěn)定的PLGC病證結合大鼠模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，5周齡，體質量（130±20）g，購于北京斯貝福生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，溫度22～24 ℃、濕度50%環(huán)境，晝夜12 h循環(huán)，自由飲水，喂食普通維持飼料。大鼠維持飼料及含0.03%雷尼替丁飼料均由沈陽茂華生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染液（貨號B1003），江蘇艾迪生生物科技有限公司；MNNG（貨號R030453-25g），蘭州科寶生物科技有限公司；25%氨水（批號202152），天津北辰方正試劑廠；無水乙醇（批號20201015），天津匯杭化工科技有限公司。磁力攪拌器，杭州旌斐儀器科技有限公司；電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；顯微鏡（型號U-B130-2），日本OLYMPUS。

1.3 溶液配制

用1 L去離子水溶解1 g MNNG，使用磁力攪拌器使其充分溶解，配制成濃度為1 g/L的MNNG母液，置于棕色避光瓶4 ℃低溫保存，使用時用滅菌水將其稀釋成100 μg/mL溶液，置于避光飲水瓶中。使用前用滅菌水250 mL稀釋1 mL 25%氨水，配制成0.1%氨水溶液。使用前用滅菌水200 mL稀釋無水乙醇50 mL，配制成20%乙醇溶液。

1.4 分組與造模

采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組14只、模型組16只。結合課題組前期造模經(jīng)驗[11-12]及相關文獻[13-14]，模型組大鼠以MNNG為主的五因素復合造模法進行造模：①每日以100 μg/mL MNNG溶液供大鼠自由飲用；②正常進食2 d，再禁食1 d；③禁食當日采用20%無水乙醇2 mL/只灌胃，灌胃前后禁水1 h；④禁食當日停止飲用MNNG溶液，改為0.1%氨水自由飲用；⑤除禁食日外，每日以0.03%雷尼替丁飼料供大鼠自由食用。連續(xù)造模26周。正常對照組大鼠正常飼養(yǎng)。

1.5 取材

造模結束后，大鼠禁食18 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.2 mL/100 g）麻醉，剖腹，取全胃，沿胃大彎側剪開，去除胃內容物并用生理鹽水沖洗，在濾紙上展開胃組織，測量胃組織大小，觀察是否有黏膜損傷，若有損傷在損傷部位切取條狀組織（1 cm×2 mm），若無損傷則在近胃小彎側從胃體延伸至胃竇切取條狀組織，置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色，光鏡下觀察大鼠胃黏膜腸化及異型增生情況。

1.6 表征采集

結合《中醫(yī)診斷學》[15]及相關文獻[8，16]設計大鼠表征觀察量表，3名實驗人員造模前每周根據(jù)大鼠表征觀察量表（見表1）對大鼠表征觀察1次，若產(chǎn)生分歧，采用2人同意原則。大鼠證候特征判斷參考《中醫(yī)診斷學》[15]，表征比率=陽性表征大鼠數(shù)量÷大鼠總數(shù)。

表1 大鼠表征觀察量表

1.7 食水量觀察

每周測量大鼠體質量和24 h進食量，每日測量大鼠24 h飲水量。

1.8 HE染色

造模第17周末各組隨機抽取2只大鼠、造模結束后將所有剩余大鼠取材，對胃黏膜組織進行HE染色。根據(jù)《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》[17]及《中國胃黏膜癌前狀態(tài)和癌前病變的處理策略專家共識（2020年）》[18]進行病理診斷。腸化即化生性萎縮，指胃黏膜腺體有腸化生者。腸化分度：腸化區(qū)域占腺體和表面上皮總面積1/3以下為輕度，≥1/3～2/3為中度，2/3以上為重度。異型增生指上皮有明顯的細胞和/或結構異常，呈腫瘤生長性質，而無固有膜浸潤。按非典型性細胞累及上皮的范圍分為輕、中、重3級。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行分析。符合正態(tài)分布計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡情況

正常對照組大鼠因互相撕咬致死亡2只。模型組大鼠死亡2只，其中1只因胃腸脹氣導致意外死亡，另1只大鼠死亡前體質量進行性減輕，精神萎靡，活動減少，抓捕反應遲鈍，毛發(fā)凌亂、枯槁、發(fā)黃，眼神黯淡，唇甲色白。解剖后觀察胃組織病理顯示：胃絨毛排列紊亂，絨毛間出現(xiàn)充血現(xiàn)象，細胞形態(tài)不一，出現(xiàn)大量空泡，細胞核大，有大量炎性細胞浸潤，基底層有出血現(xiàn)象。

2.2 2組大鼠唇色及舌色比較

正常對照組大鼠唇色淡紅，舌質紅潤；模型組大鼠唇色青紫，舌質黯紅。見圖1。

圖1 2組大鼠第26周唇色及舌色形態(tài)

2.3 2組大鼠表征變化

與正常對照組同一時期比較，模型組大鼠出現(xiàn)活動度減少（第6～26周）、唇淡白（第12～24周）、舌淡白（第12～24周）、爪淡白（第12～26周）、毛枯黃無澤（第18～26周）、倦怠嗜臥（第18～26周）、大便不成形（第18～26周）、眼黯紅（第18～26周）、唇青紫（第18～26周）、舌黯紅（第18～26周）、爪黯紅（第24～26周）、尾部瘀點（第24～26周），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 2組大鼠表征比率比較

2.4 2組大鼠體質量、24 h進食量和飲水量變化

與正常對照組比較，模型組大鼠第6周開始體質量明顯降低（P＜0.01），24 h進食量和飲水量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 2組大鼠體質量、24 h進食量和飲水量比較（）

表3 2組大鼠體質量、24 h進食量和飲水量比較（）

注：與正常對照組同一時期比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常對照組模型組24 h飲水量/mL 44.30±3.65 47.60±2.88 52.40±1.50 53.50±1.84 57.10±2.23 58.30±2.41 45.20±2.70 33.42±2.50**28.75±3.20**25.42±2.81**22.92±4.60**22.67±3.28**只數(shù)10 10 10 10 10 10 12 12 12 12 12 12時間造模前第6周第12周第18周第24周第26周造模前第6周第12周第18周第24周第26周體質量/g 139.23±12.21 408.93±40.06 538.22±39.74 555.60±35.50 562.60±36.58 572.61±40.91 139.80±11.90 293.80±21.39**358.21±25.44**398.18±20.59**423.45±20.86**429.56±25.53**24 h進食量/g 29.03±3.06 30.01±3.07 30.67±2.90 31.17±2.94 31.81±2.78 33.16±3.04 30.85±2.65 27.33±1.89*26.58±1.93**23.99±2.97**23.32±2.80**22.50±2.92**

2.5 2組大鼠胃組織病理變化

正常對照組大鼠胃組織未見病變；模型組大鼠胃壁變薄，胃黏膜灰白、蒼白，黏膜皺襞異常集中或變平，走向紊亂、欠規(guī)則，可見散在糜爛帶及糜爛點。見圖2。

圖2 2組大鼠胃體形態(tài)

HE染色顯示，模型組10只大鼠（83.3%）胃黏膜表現(xiàn)為腸上皮化生或輕至重度異型增生，腺體排列擁擠、紊亂，細胞形態(tài)不一，可見大量杯狀細胞，細胞漿嗜堿性，細胞核大、深染、不規(guī)則，黏膜肌層浸潤破壞，病理診斷為PLGC。另外2只大鼠胃黏膜固有腺體萎縮，病理診斷為慢性萎縮性胃炎。見表4、圖3。

表4 2組大鼠胃組織病變情況（只）

圖3 2組大鼠胃黏膜形態(tài)（HE染色，×200）

3 討論

目前，西醫(yī)治療PLGC以根除幽門螺桿菌感染、內鏡下黏膜切除（包括射頻消融和氬離子凝固術），以及定期行內鏡、組織病理學隨訪為主。中醫(yī)藥治療PLGC通過多靶點、多層次發(fā)揮保護胃黏膜、調節(jié)免疫、影響細胞增殖分化、抗氧化等作用，體現(xiàn)了中醫(yī)“治未病”思想，與現(xiàn)代預防醫(yī)學理念不謀而合。動物證候模型是基礎研究和臨床實踐相互轉化的紐帶，也是揭示中醫(yī)藥干預機理的重要載體[19]。因此，本研究在以MNNG復合造模法構建疾病模型基礎上根據(jù)中醫(yī)病因病機理論，結合飲食失宜、濕熱邪氣等特定致病因素，模擬PLGC特征，建立中醫(yī)“證”的動物模型，通過動態(tài)觀察大鼠表征、胃組織病理變化對模型進行驗證。造模初期（第6周），大鼠出現(xiàn)活動度減少、唇舌色淡、毛枯黃無澤、爪甲淡白等氣虛證表現(xiàn)；第12周出現(xiàn)大便不成形，推測氣虛可能以脾胃氣虛為主；第18周出現(xiàn)舌黯紅、唇青紫、爪黯紅等血瘀證表現(xiàn)。表明MNNG復合造模法復制PLGC大鼠模型初期以脾胃氣虛證為主，后期在氣虛證基礎上兼見血瘀證。

3.1 病證結合模型特點

相較單病因法，多病因法更貼合臨床“證”形成的復雜特點。亞硝酸鹽攝入不當、幽門螺桿菌感染、飲食不規(guī)律及質子泵抑制劑濫用等因素在一定程度上已被確定為胃癌發(fā)生的危險因素。課題組結合前期動物實驗及查閱文獻后采用MNNG五因素復合法造模。具體思路如下：①MNNG自由飲用。MNNG是一種活性N-亞硝基化合物，具有很強的致突變能力，可導致DNA鏈上的堿基烷基化并產(chǎn)生致癌性[20]。早在1967年，Sugimura等[21]就以MNNG持續(xù)性飲用誘導大鼠胃腺癌模型。此后，以MNNG為基礎的造模法廣泛用于建立和誘發(fā)PLGC及胃癌動物模型。MNNG可被視為中醫(yī)理論飲食偏嗜（如長期攝入腌制、熏制食品）或飲食不潔（長期進食有毒物質）致病，日久毒邪損傷脾胃，與其他病邪相合，以致氣虛毒損[22]。MNNG灌胃操作會增加造模期間大鼠死亡率，模擬自然狀態(tài)下飲用MNNG溶液造模更接近萎縮發(fā)展至胃癌的自然病理演變，參考價值較高[15]。空腹飲用MNNG溶液在胃中停留時間相較飽腹時間縮短，使MNNG對腸道黏膜刺激較胃黏膜增加，加重MNNG致腸道腫瘤的不良反應，故本研究于禁食日停飲MNNG溶液。此外，PLGC成模率與MNNG配制濃度密切相關，濃度過低成模率降低，過高易發(fā)展為胃癌。課題組結合前期實驗研究得出，以100 μg/mL MNNG自由飲用成模率高。②胃內低酸環(huán)境容易促進細菌生長，使內源性硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，誘發(fā)胃黏膜出現(xiàn)腸上皮化生，且能加強MNNG誘變作用。雷尼替丁能通過拮抗胃壁細胞H2受體，抑制胃酸分泌，故常與MNNG溶液配合使用[4]。③無水乙醇作為一種高刺激性攻擊因子，當濃度過高或攝入量過多時，會使胃黏膜屏障失衡，促使炎癥因子釋放，損傷胃黏膜[23]。此外，相關研究表明，乙醇可以促進MNNG溶解，提高PLGC誘發(fā)率，縮短造模時間[24]。《醫(yī)意商》載：“蓋酒之傷人，濕而且熱，濕熱之毒，永久不變。”酒毒性屬濕熱，過量攝入乙醇致濕熱毒邪內蘊，損傷脾胃，脾失健運，以致氣血不和。④饑飽失常法是模擬人類因不規(guī)律進食而導致胃黏膜損傷。基于“谷不入半日則氣衰，一日則氣少矣”（《靈樞·五味》）的中醫(yī)理論，本課題組采用正常進食2 d再禁食1 d的饑飽失常法作為復合造模方式之一。“氣者血之帥也，氣行則血行，氣止則血止，氣有一息之不運，則血有一息之不行”（《普濟方·方脈總論》）。氣為血之帥，氣虛無力行血、攝血，則血行異常，或停滯脈管留瘀，或血出致瘀。⑤幽門螺桿菌感染是造成PLGC的主要病因，中國幽門螺桿菌感染率（56%）高于英國和美國（分別為35.5%、35.6%）[25]，這可能是中國胃癌發(fā)病率較高的原因之一。幽門螺桿菌通過尿素酶分解尿素，產(chǎn)生大量氨，從而刺激胃黏膜細胞出現(xiàn)炎癥、萎縮等病理改變[6]。氨水正是模擬在幽門螺桿菌感染狀態(tài)下高濃度氨對胃黏膜的毒性損害，造成大鼠胃黏膜持續(xù)受損，故用0.1%氨水于禁食日自由飲用。此外，實驗研究表明，氨水與MNNG溶液、雷尼替丁聯(lián)用可有效縮短PLGC成模期，提高成模率[26]。

3.2 造模過程思考與總結

①造模動物選擇。選擇合適的造模動物是成功建立病證結合動物模型的首要條件，綜合國內外相關文獻[27-28]，應用最多的復制PLGC模型的動物是4～12周齡大鼠，且相較Wistar大鼠，SD大鼠適應性和抗病性更強[6]。因此，本課題組選擇5周齡SD大鼠作為模型動物。②灌胃操作。灌胃操作易誘發(fā)前胃癌，而人類95%以上的胃癌為腺癌，故理想的模型大鼠病變部位應在后胃。因此，在灌胃操作前，對操作者灌胃手法進行針對性培訓以盡量避免灌胃失誤造成模型差錯。③MNNG溶液飲用方式。鑒于MNNG需要低溫、避光保存，故造模初期課題組使用錫箔紙包裹瓶身，但大鼠具有喜嚙咬的生理特性，可觸及并吞食錫紙，故改用黑色油性筆涂黑并晾干飲水瓶。此外，每日檢查飲水瓶有無缺口、毛刺以防劃傷大鼠口鼻。④乙醇濃度。胃腸脹氣是造模過程中大鼠致死的主要原因之一，由于乙醇產(chǎn)氣較多，與MNNG協(xié)同會加劇胃腸脹氣，故復合造模應注意乙醇濃度及干預頻率。本課題組結合前期造模經(jīng)驗，于禁食日停止飲用MNNG溶液，改用20%乙醇灌胃，結果較為理想。⑤大鼠喂食時間。本研究造模過程中，正常組2只大鼠因互相撕咬致死，其原因可能是夜間飼料不足，爭搶飼料時發(fā)生打斗所致。大鼠具有夜間采食的生理特性，故應在傍晚足量喂食，避免打斗傷亡。

本課題組基于前期臨床及實驗研究，認為PLGC核心病機為脾胃氣虛、胃絡瘀阻，二者常互為因果，脾胃受損，脾失健運，胃失和降，中焦氣機阻滯，則出現(xiàn)氣滯、血瘀、濕阻。以上病理產(chǎn)物進一步阻礙脾胃功能，致氣血生化乏源，脾胃益虛，瘀血深伏脈絡，出現(xiàn)由氣及血、由經(jīng)入絡的緩慢發(fā)展過程。《慢性萎縮性胃炎中西醫(yī)結合診療共識意見（2017年）》[29]提出，脾胃虛弱與氣滯血瘀相互影響，貫穿疾病始終。因此，本研究以PLGC氣虛血瘀證動物模型為切入點，通過運用改良后的大鼠造模方法，為建立穩(wěn)定、可靠的PLGC病證結合動物模型提供較理想、安全的方法，以期促進PLGC氣虛血瘀證動物模型的規(guī)范化及標準化。