新生兒原發性肉堿缺乏癥基因攜帶者生化和遺傳特征研究*

楊金玲，陳大宇，譚建強，黃麗華，韋江艷，寧海萍

廣西科技大學附屬婦產醫院/廣西科技大學附屬兒童醫院/廣西壯族自治區柳州市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣西柳州 545000

原發性肉堿缺乏癥(PCD)是由SLC22A5基因突變引起的脂肪酸氧化障礙，屬于一種常染色體隱性遺傳病[1]。不同國家或不同種族人群的PCD發病率大多為1/40 000～1/120 000[2]；而在法羅群島，PCD是一種常見疾病，發病率為1/300[3]。PCD患者可患有骨骼肌或心肌病、肌無力和肝性腦病，如果不規范治療，患者終身有猝死風險[4]。若進行科學及時的規范治療，患者的大多數癥狀可逆，長期預后良好[5]。在新生兒期，通過串聯質譜技術測定干血斑(DBS)中游離肉堿(C0)的水平篩查PCD的報道較多，但關于PCD的遺傳特征和C0水平間關系的報道有限。新生兒DBS中C0的水平是否能提供新生兒PCD的相關信息尚不清楚。本研探討了不同SLC22A5基因突變攜帶者C0水平，為通過C0篩查PCD提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究為回顧性研究，研究對象為2017年在本院出生的新生兒。排除以下新生兒：父母拒絕進行高通量測序者；有重大先天性異常以及妊娠期間母體有并發癥，如子癇前期、糖尿病、膽汁淤積、羊水過少和羊水過多等。共2 093例新生兒納入本研究，新生兒監護人均簽署知情同意書，并通過本院倫理委員會批準。根據是否檢出SLC22A5基因變異分為無變異基因組和攜帶變異基因組。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)遺傳變異分類標準與指南，將攜帶的基因變異分為一類(致病基因變異)、三類(非致病基因變異)和臨床意義未明(UVS)變異。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集出生72 h并充分哺乳的新生兒足跟血滴于S&S903TM專用濾紙片，室溫干燥后5個工作日內遞送到實驗室進行相關檢測。

1.2.2質譜檢測 使用非衍生化串聯質譜試劑盒(廣州豐華公司)進行游離肉堿檢測。根據試劑盒要求對DBS進行預處理，使用串聯質譜系統(美國ABI 3200型)進行分析。

1.2.3基因檢測及分析 基因檢測在北京市兒科研究所出生缺陷遺傳學研究室進行。使用TIANamp Blood DNA試劑盒(Tiangen公司)提取DBS基因組DNA。采用二代測序技術檢測與遺傳性代謝紊亂相關的166個已知基因的外顯子組。北京市兒科研究所出生缺陷遺傳學研究室提供二代靶向測序對SLC22A5基因變異的解讀報告。經檢索PubMed上相關文獻、人類基因變異數據庫及ClinVar，明確致病性變異位點，計算人群SLC22A5基因已知致病變異攜帶率。

1.4統計學處理 采用SPSS24.0統計軟件進行數據處理。計量資料采用M(P25,P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較用Kruskal-WallisH檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1新生兒總體情況 2 093例新生兒中，男性1 091例，女性1 002例。基因正常組1 988例(94.60%)，C0水平為25.83(21.22，34.34)μmol/L；攜帶變異基因組105例(5.40%)，C0水平為24.35(19.77，29.75)μmol/L。兩組新生兒C0水平比較差異有統計學差異(P<0.05)。

2.2基因分析 在2 093例新生兒中，共檢測105例新生兒攜帶35種SLC22A5基因變異。其中攜帶一類變異者20例，發現4種基因變異；根據出現頻次，依次為c.51C>G(13例)、c.1400C>G(5例)、c.338G>A(1例)、c.517delC(1例)；攜帶c.51C>G和c.1400C>G變異者占致一類變異的90%(18/20)，人群的致病變異攜帶率為1/105(20/2 093)。攜帶三類變異者18例，發現8種基因變異。攜帶UVS變異者75例，發現23種基因變異。見表1。

表1 新生兒攜帶SLC22A5基因的變異類型

續表1 新生兒攜帶SLC22A5基因的變異類型

2.3各組新生兒C0水平比較 各組新生兒出生胎齡和體質量差異無統計學意義(P>0.05)，而C0水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。基因正常組C0水平與一類變異組水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，而與三類基因變異組及VUS變異組水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。一類基因變異組C0水平最低，與三類變異組和VUS組C0水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。三類變異組和VUS變異組C0水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組新生兒C0水平比較[M(P25,P75)]

3 討 論

PCD是由編碼新型有機陽離子轉運體(OCTN2)的SLC22A5基因突變引起的遺傳性疾病，可導致肉堿轉運障礙，脂肪酸氧化受損。中國各地PCD的發病率差異較大，寧波PCD的發病率為1/16 595[6]，徐州為1/23 637[7]，廣州約為1/13 345[8]。柳州市新生兒PCD發病率為1/9 332，在脂肪酸代謝疾病中發病率最高[9]。

已報道的SLC22A5基因突變有180多種，大部分為錯義突變，其次是無義突變和移碼突變，而剪接位點突變比較少見；最常見的突變是外顯子1[10]。本研究的2 093例新生兒中，檢出一類變異20例，其中c.51C>G突變發生次數為13次，占一類變異的65.0%(13/20)。c.51C>G突變在柳州人群中具有較高的攜帶率，是本研究中SLC22A5基因最常見的突變。本地區其他SLC22A5致病突變依次為c.1400C>G、c.338G>A和c.517delC。SLC22A5基因的突變熱點在全球不同種族和地區之間存在差異。據報道，c.760C> T變異是中國人群主要的變異，但是該變異在本研究中未被檢出，也許是研究樣本不夠大所致[11]。本研究第一熱點變異c.51C> G與湖南地區的相同，變異頻率高于湖南地區(27%)[12]。據報道，PCD致病性變異攜帶者3-甲基谷胱甘肽酸尿(3-MGA)升高，在沒有其他代謝物的情況下，3-MGA升高被認為是線粒體疾病的標志[13]。在新生兒期篩查PCD攜帶者可提示后代可能的發病風險，亦可以提示其他線粒體疾病；同時，新生兒的攜帶者狀況提示對父母和家庭成員進行風險評估具有重要意義。

各地廣泛采用串聯質譜法檢測DSB中C0水平來篩查PCD，診斷閾值為≤10 μmol。本研究結果顯示，檢出SLC22A5基因變異的新生兒C0水平低于基因正常的新生兒，高于該PCD篩查的診斷閾值；一類變異組C0水平顯著低于三類變異組和UVS變異組。由此可見，通過C0水平可初步篩查PCD致病基因攜帶者。根據ACMG變異分類，常染色體因隱性遺傳病的疾病，一類基因變異的純合變異或復合/雜合變異可導致疾病的發生；三類變異和UVS的臨床意義未明，其純合變異或復合/雜合變異致病可能性小[14]。臨床上PCD致病基因攜帶者通常是偶然被發現的，通過生化檢測篩查一類變異基因的攜帶者，可以實現群體篩查，篩查潛在的患者，早診斷早治療，降低新生兒群體中殘疾和疾病的患病率。測序技術飛速發展提高了其在新生兒疾病篩查中應用的可能性。NGS具有篩查范圍廣、靈敏度和特異度較高及高通量的優勢[15]。但NGS在新生兒疾病篩查中應用的費用、檢測周期和倫理道德等方面仍然存在爭議。本研究提示，通過檢測新生兒DBS中C0的濃度，初步篩查可疑新生兒PCD一類變異基因的攜帶者；NGS可作為生化篩查陽性實驗室篩查結果的確認測試。二者聯合使用能夠快速準確確定基因型，降低經濟負擔及監護人的焦慮情緒，同時為遺傳咨詢提供依據[16]。如果新生兒DBS中C0的水平低于篩查切值，靶向測序未能檢測出變異基因，提示此變異可能未在檢測范圍內，應根據C0的水平和臨床癥狀選擇進一步檢測的方式。這項研究的一個主要局限性是僅對于靶基因編碼區的外顯子組進行測序，無法檢測到調控區域或內含子中的致病變異，以及無法檢測致病基因的大片段缺失/重復或拷貝數變異。最近發現SLC22A5基因的5′非翻譯區c.-149G>A變異被認為是PCD的常見原因，但本研究的NGS并未涵蓋該變異[17]。

綜上所述，本研究探討了柳州地區新生兒PCD攜帶者基因型和生化表型之間的關系，為通過C0水平篩查PCD致病變異攜帶者提供依據；SLC22A5基因c.51C>G突變在本地區人群中檢出率最高，屬本地區熱點突變。通過檢測C0水平可篩查PCD致病變異攜帶者，為篩查關口前移至一、二級預防提供依據。