益氣瀉肺湯對慢性心力衰竭大鼠心臟及認知功能的影響

黑穆榮，朱海燕，2，張心愛，竇晉芳，高瑜倩，張洪嘉，王志淼，彭嘉冉，趙 勇

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為多種慢性心臟疾病的晚期危重階段，其發病率逐年快速增長并不斷攀升[1]。根據調查數據顯示，住院CHF病人中，有將近50%的病人存在不同程度的認知功能紊亂，其中，很大一部分會逐漸發展為癡呆[2-3]。而認知障礙的出現將直接導致CHF病人自我監測與自我護理能力降低，致使病情進一步加重甚至死亡風險進一步增高，社會醫療衛生資源消耗增加[4]。這迫使人們將更多目光聚集到心臟和大腦的相互關系方面。中醫認為“心主血脈”“心主神明”，心腦之間聯系密切，從心論治CHF認知障礙具有重要研究價值。益氣瀉肺湯是由我國首都國醫名師郭維琴教授自主研制的一種治療心力衰竭的基礎方，臨床上通過辨證論治進行應用時，多增加遠志、石菖蒲等安神益智、祛痰開竅之品來治療CHF伴認知功能障礙，且療效顯著[5]。本研究觀察益氣瀉肺湯對CHF大鼠心臟和認知功能的影響，探討其可能的作用機制，為中醫藥治療CHF同時改善認知功能提供新的治療方法和思路。

1 材料與方法

1.1 主要藥物 益氣瀉肺湯主要成分為人參、生黃芪、車前子、茯苓、桑白皮、葶藶子、遠志、石菖蒲等，由北京中醫藥大學東直門醫院中藥房提供顆粒劑。

1.2 動物 無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠24只，12周齡，體質量(210±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006，于北京中醫藥大學東直門醫院SPFⅡ級動物房分籠飼養，室內溫度(25±2)℃，濕度(60±10)%，每籠5只，喂養大鼠合成飼料，自由飲水，室內24 h光線照明，全自動通風系統。

1.3 主要試劑 血清血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(AMEKO，貨號AE90173Ra)；戊巴比妥鈉(上海艾研生物有限公司，批號：081130251)；注射用青霉素鈉(中諾藥業有限公司，批號：H13021632)。

1.4 主要儀器 ALC-V8小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)，心電圖機(CardiMax，FX-7202)，超高分辨率小動物超聲影像系統(FujiFilm Visual Sonics)，Morris水迷宮系統(上海移數科技有限公司，MD-021)，低溫高速離心機(北京白洋醫療器械有限公司，BY-R320)，電子天平(上海菁海儀器有限公司，JA2003N)，Thermo酶標儀，恒溫箱(上海福瑪實驗設備有限公司，GHX9160 B-2)，相機(Canon EOS Kiss X7i)等。

1.5 方法

1.5.1 模型制作 術前給予大鼠1%戊巴比妥鈉并按100 g體質量0.5 mL腹腔注射以有效麻醉大鼠，固定大鼠四肢及頭部，胸部術區備皮，碘伏常規消毒，在無影燈直視下行氣管插管，呼吸機設定頻率80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量按100 g體質量3～4 mL，在心臟搏動最明顯處，胸骨左緣約1 cm處切開皮膚及肌層，順第3肋或第4肋間隙方向分開肋骨，暴露心臟，在左心耳邊緣下2 mm處結扎左冠狀動脈前降支，閉胸后消毒切口，術后腹腔注射少量青霉素以預防感染。 若術后第 2 天心電圖顯示病理性 Q 波至少分布于Ⅰ、aVL、V3～V6導聯，可兼有V1、V2導聯，且病理性Q波大于7個，則判斷為造模成功[6]。

1.5.2 動物分組及給藥劑量 將實驗大鼠分為模型組、假手術組、益氣瀉肺湯組，每組8只，模型組與益氣瀉肺湯組大鼠根據心電圖Q波數量分層隨機分組。于術后第2天開始給藥，益氣瀉肺湯組予益氣瀉肺湯13 g/(kg·d)灌胃，假手術組及模型組按100 g體質量1 mL純凈水灌胃，共給藥8周。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 大鼠心功能檢測 取材前所有實驗大鼠行彩色多普勒超聲心動圖檢查，分別取左室乳頭肌短軸切面、左室長軸切面，測定大鼠左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)，每只大鼠測量 3 次，以平均值為最終結果。

1.6.2 心肌組織病理變化 沿著心臟最大橫徑位置進行橫切，選擇部分組織先用4%多聚甲醛固定，24 h后進行常規石蠟包埋，4 μm連續切片。經脫蠟、染色、脫水、透明和封片等蘇木精-伊紅(HE)染色標準流程后通過顯微鏡拍攝并分析圖像，觀察心肌組織的病理形態學變化。

1.6.3 舌象 取材前進行舌象采集：采集前用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，解剖板固定大鼠四肢，用鑷子輕輕夾起大鼠舌頭，暴露舌腹面，于每日同一時間、相同光源下用相機拍攝大鼠舌腹面，采集大鼠舌象。

1.6.4 大鼠Morris水迷宮實驗 假手術組、模型組、益氣瀉肺湯組大鼠給藥8周后行水迷宮實驗，包括定向航行實驗(place navigation performance，PNP)以及空間探索實驗(spatial probe performance，SPP)，目的是通過分析大鼠尋找平臺的潛伏期以及穿越平臺區域次數變化，觀察大鼠尋找平臺路程，從而測試大鼠對平臺位置的記憶能力和空間學習能力。

1.6.5 血清AngⅡ檢測 經腹主動脈采集大鼠血液后，轉速3 000 r/min，4 ℃溫度下離心10 min，取血清，采用ELISA法檢測各組大鼠血清AngⅡ水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1 3組大鼠心臟超聲指標比較 與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，益氣瀉肺湯組LVEF、LVFS水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。3組大鼠心臟超聲收縮期圖像見圖1。

表1 3組大鼠LVEF、LVFS水平比較(±s) 單位：%

圖1 3組大鼠心臟超聲收縮期圖像 (A為假手術組；B為模型組；C為益氣瀉肺湯組。箭頭標示為3組大鼠心臟收縮期圖像)

2.2 3組大鼠心肌組織病理結果比較 假手術組大鼠心肌組織形態正常，結構清楚，細胞排列整齊致密，胞核尺寸均一；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，出現水腫、變性、壞死，胞核固縮，細胞間隙增大，可觀察到大量炎性細胞浸潤；益氣瀉肺湯組大鼠的心肌結構較模型組有不同程度的改善，心肌纖維較完整，排列較整齊，少量炎性細胞浸潤，細胞染色相對較均勻。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理結果比較(HE，×200)(箭頭標示為肥大的心肌細胞，且可以看到胞核固縮)

2.3 3組大鼠舌象觀察 通過觀察采集到的大鼠舌象，發現模型組大鼠舌腹面舌色較假手術組紫暗，而益氣瀉肺湯組大鼠舌質瘀滯程度較模型組改善。詳見圖3。

圖3 各組大鼠舌象

2.4 水迷宮實驗結果

2.4.1 3組大鼠逃避潛伏期比較 水迷宮實驗進行3d，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，益氣瀉肺湯組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 3組大鼠逃避潛伏期比較

2.4.2 3組空間探索實驗穿越平臺次數比較 與假手術組比較，模型組大鼠穿越平臺次區域數明顯減少(P<0.05)，與模型組比較，益氣瀉肺湯組穿越平臺區域次數顯著增多(P<0.05)。詳見表2及圖5。

表2 3組大鼠穿越平臺區域次數比較(±s) 單位：次

圖5 3組大鼠空間探索實驗軌跡圖比較

2.5 3組大鼠血清AngⅡ濃度比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清AngⅡ濃度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，益氣瀉肺湯組大鼠血清AngⅡ濃度明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組大鼠血清AngⅡ濃度比較(±s) 單位：ng/L

3 討 論

CHF病人認知功能障礙的發生率與日俱增，并且CHF確診人群中40%～50%在6個月內會再次入院，而部分病人再入院可能與其認知功能障礙有關[7]。因此，心臟功能受損和認知水平下降之間的惡性循環，仍是一個值得關注的問題[8]。深入研究心與腦的關系對于提高CHF病人生活質量、降低再入院率及死亡率具有重要意義。目前針對CHF伴認知功能障礙的治療有血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)等藥物療法，心臟移植和再同步治療手術途徑以及聯合有氧運動、認知訓練、理療等多種方案[9]，但在人群普適度、藥物不良反應等方面依舊存在一定的限制性，與此同時，中醫藥治療CHF并改善認知功能的臨床療效具有明顯優勢。

中醫認為心腦之間的關系密不可分，近代醫學家張錫純很早提出“心腦共主神明”，心的精氣流注于腦，神得到充養而使腦主宰人體生命活動，產生思維意識，支配相應行為[10]，心腦通過臟腑經絡在結構上相互連接，功能上相互協調，共同統攝人體精神及軀體活動。CHF屬中醫“心水”“心悸”“喘證”等范疇，該病病位在心，以氣短、喘憋、心慌為主要表現。郭維琴教授認為氣虛血瘀、陽虛水泛型心力衰竭在臨床最為常見，以外感風邪、情志內傷、勞逸失節等為誘因，耗傷心氣，氣虛可致陽虛，血液失其溫煦，津液運行停滯，則水停擾肺[11-12]，若心氣虛則推動無力、瘀血痰濁阻閉心竅，日漸腎精虧虛，可致神失所養，髓減腦消，神機失用，發為癡呆[13]。因此，郭維琴教授認為在臨床治療CHF伴認知障礙時應注意攻補兼施，堅持益氣活血為主，兼顧溫陽利水的基本法則。益氣瀉肺湯方中人參、生黃芪補元氣，溫通心陽，桑白皮、葶藶子瀉肺氣，消痰平喘，車前子、茯苓健脾氣，利水滲濕，配遠志以安神益智，佐菖蒲以開竅豁痰，同川芎、郁金達活血理氣通絡之效[14]。已有臨床試驗證實，與單純西藥治療比較，聯合中醫益氣瀉肺治法能夠大幅提高病人LVEF，減低病人血清氨基末端B型尿鈉肽前體(NT-proBNP)水平，明顯改善病人心力衰竭癥狀，提高生活質量[15]。

本實驗結果顯示，經過益氣瀉肺湯干預后，CHF大鼠超聲心動圖可見心肌收縮能力較模型組提高，LVEF、LVFS水平較模型組提高，證實益氣瀉肺湯可以改善CHF大鼠心臟泵血功能；HE染色病理結果顯示，益氣瀉肺湯組大鼠心肌細胞相對于模型組排列整齊，且細胞水腫及炎性細胞浸潤程度均減輕，提示益氣瀉肺湯能夠在一定程度上改善心肌纖維化，延緩心室重構。結合大鼠舌象，模型組大鼠舌象較假手術組紫暗，符合氣虛血瘀型CHF證型特點，益氣瀉肺湯組大鼠舌腹面舌色瘀暗程度較模型組明顯改善，提示大鼠氣虛血瘀的程度得到緩解。水迷宮實驗結果顯示，模型組大鼠較假手術組逃避潛伏期延長，穿越平臺區域次數減少，說明CHF大鼠確已存在空間學習以及記憶能力下降，而益氣瀉肺湯組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，穿越平臺區域次數較模型組增多，證實益氣瀉肺湯能夠提高CHF大鼠空間學習和記憶能力。

目前關于CHF導致認知功能障礙的機制尚不統一，許多研究者認為CHF認知功能障礙與大腦低灌注相關[16]。然而，在射血分數保留的CHF病人中，認知障礙的出現也同樣常見，說明心力衰竭引起的癡呆不完全是腦的低灌注所致[17]。在心力衰竭病人血壓偏低的情況下繼續給予 ACEI類藥物治療，仍能夠使認知障礙得到極大的改善，提示 ACEI 對于認知功能的改善獨立于其降壓作用[18]。有研究表明，CHF病人腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統激活，釋放過多的神經遞質與積聚的Aβ淀粉樣蛋白具有神經元細胞毒性，進而導致記憶力減退、執行能力下降等認知功能損傷[19-20]。另有實驗動物證實，AngⅡ促進轉化生長因子-β(TGF-β)釋放增加，催化炎癥反應，導致神經細胞腫脹、壞死、凋亡，促進認知功能障礙發生發展[21]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清AngⅡ濃度較假手術組明顯升高，益氣瀉肺湯組大鼠血清AngⅡ濃度較模型組顯著減少，提示益氣瀉肺湯改善CHF認知功能障礙可能與下調AngⅡ水平有關。

綜上所述，益氣瀉肺湯能夠改善CHF大鼠心臟泵血功能，延緩心肌重塑進程，整體改善心臟功能，并且通過降低CHF大鼠血清AngⅡ濃度，抑制RAAS系統，對改善大鼠認知水平起到積極作用。