綠豆資源萌發期抗旱指標篩選及抗旱性鑒定

張思雨，郭亞寧，艾 靜，張盼盼，王富剛

（榆林學院 生命科學學院，陜西 榆林 719000）

綠豆（Vigna radiata（L.）Wilczek）作為我國主要的食用豆之一，其籽粒富含蛋白質、脂肪和抗氧化物質等[1-2]，且生育期短、抗逆性強，是重要的藥食同源作物[3-4]。陜北榆林地處毛烏素沙地南緣，接壤黃土高原[5]，土壤沙質，光照充足，晝夜溫差大，是綠豆的優勢產區[6-8]。

榆林市橫山區的橫山大明綠豆，因籽粒飽滿、色澤鮮亮、營養含量豐富，暢銷日本、韓國等地，是我國的地標作物[9]。榆林地區屬于溫帶季風氣候，雨熱同季，春季降雨量少，綠豆在榆林地區5月中下旬種植，降雨量少導致綠豆出苗困難，嚴重影響當地綠豆產業的發展。因此，在發芽期進行綠豆資源的抗旱性鑒定，對于當地的綠豆產業發展意義深遠。

以PEG 6000（聚乙二醇）高滲溶液模擬干旱脅迫條件是目前常用方法之一[10-11]，在各種作物中使用普遍[12-16]。干旱處理發芽期種子，會導致種子在形態、生理和分子方面均發生變化。形態方面研究較多的指標包括發芽勢[17]、發芽率[18]、發芽指數[19]、抗旱系數、胚根長度、胚芽長度、干物質等，干旱脅迫導致種子發芽受到抑制，發芽率和發芽勢下降，胚根伸長受阻，不能有效吸收水分，胚芽發育緩慢[20]。生理指標方面測定的指標包括脯氨酸含量、丙二醛（Malonodialdehyde，MDA）、可溶性蛋白、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活力、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等[21]。

干旱脅迫引起細胞膜的滲透勢變化，細胞內發生一系列抗氧化反應，過氧化物在胞內累積，抗氧化酶活力增強[22]。因此，通過形態指標和生理指標綜合評價綠豆資源的抗旱性，對于綠豆的抗旱性鑒定具有實踐意義。

本研究利用15% PEG 6000模擬干旱脅迫條件，基于40份綠豆資源，測定不同綠豆資源的形態指標和生理指標，通過變異系數分析、相關性分析、隸屬函數分析、生理指標分析和聚類分析等，構建40份綠豆資源的抗旱性評價指標體系，以篩選出抗旱綠豆資源，旨在為榆林綠豆的抗旱性育種奠定理論基礎和資源基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究選取40份綠豆資源作為材料，按照順序編碼為 LD01～LD40（表 1），其中，LD01～LD39為全國各地主栽綠豆品種，由西北農林科技大學小雜糧研究團隊提供；LD40為榆林地區主栽綠豆品種榆綠1號，榆綠1號由榆林市農技推廣中心提供。

表1 供試綠豆的編號及來源Tab.1 Codes and sources of different mung beans

1.2 試驗方法

利用15% PEG 6000模擬干旱脅迫條件[23]，選取健康、飽滿的綠豆籽粒，清洗干凈后晾干，0.5%的次氯酸鈉滅菌7 min，蒸餾水清洗干凈，濾紙吸干水分，晾24 h后備用。取干凈的培養皿，稱質量后標記質量，每個培養皿中放入直徑11 cm的干凈濾紙，均勻擺放綠豆籽粒30粒。各資源設置處理和對照，處理取10 mL 15% PEG 6000溶液，對照取10 mL純凈水，分別倒入培養皿中，稱質量并標記質量和資源編號。將所有培養皿置于培養箱中，設置恒溫25 ℃，黑暗條件下培養6 d。每個資源設置3個重復。

1.3 形態指標及生理指標測定

以胚根長度≥種子長度為發芽標記，每日定時記錄發芽種子數，并根據質量差稱質量進行補水。6 d后，隨機選取10粒，測定鮮質量、根長、MDA和可溶性蛋白含量，計算相對發芽勢（Relative germination potential，RGP）、相對發芽率（Relative germination rate，RGR）、相對發芽指數（Relative germination index，RGI）和相對活力指數（Relative vitality index，RVI）[24-25]。可溶性蛋白含量測定參照文獻[26]的方法進行，MDA含量測定參照文獻[27]的方法進行。

1.4 抗旱性綜合評價

參照郝俊峰等[28]的方法，采用模糊數學隸屬函數法對40份綠豆資源進行抗旱性綜合評價。

式中，Xj代表某一指標的隸屬函數值，X代表某一指標的測定值；Xmax和Xmin分別表示該指標的最大值和最小值。

式中，Vj代表某指標的標準差系數代表某一指標的隸屬函數平均值；Wj代表某指標的權重系數；D代表某材料所有指標的綜合評價值（D值越大，表示抗旱性越強，反之較差）。

1.5 數據處理

利用Excel 2010進行數據整理，計算各形態指標及生理指標的值；通過SPSS 25.0軟件進行主成分分析，計算載荷值和方差貢獻率等[29]。

2 結果與分析

2.1 綠豆資源抗旱性相關指標的分析

干旱處理6 d后，對40份綠豆資源進行8個抗旱性指標測定，結果如表2所示。

表2 抗旱指標的變異Tab.2 Variation of drought resistant indexes %

從表2可以看出，15% PEG處理6 d后，各綠豆資源的發芽率、發芽勢、發芽指數、胚根長度和活力指數均下降，8個抗旱指標的變異系數分布在25%～313%；活力指數反映不同綠豆資源的發芽速度及生長狀況[30]，活力指數越大，綠豆資源的抗旱性越強，相對活力指數平均值為12.28%，參照品種榆綠1號的相對活力指數為12.41%，相對活力指數最大值37.11%，最小值0.94%，變異系數為69%，表明干旱處理導致40份綠豆資源的活力指數均下降，不同資源的下降比例豐富度較高，同時40份資源間的相對發芽勢變異系數高達69%，發芽勢和活力指數可作為40份綠豆資源抗旱性鑒定的指標；MDA作為膜質過氧化產物，過量積累對植物才會造成損傷，干旱處理后，各綠豆資源的相對MDA含量變化差異明顯，平均上升至對照的55.84倍，變異系數高達313%，而可溶性蛋白含量在干旱處理后均上升6.25倍，各資源間的變異系數為70%。相對發芽率和相對鮮質量的變異系數分別為25%和30%，變異幅度較小，不是40份綠豆材料抗旱性篩選的最佳指標。發芽勢、相對活力指數、MDA和可溶性蛋白含量的變異系數高，說明其是抗旱性篩選的重要指標。

2.2 抗旱性指標的相關性分析

抗旱性指標的相關性分析如表3所示。

表3 抗旱性指標的相關性分析Tab.3 Correlation analysis of drought resistance indexes

為了進一步分析各指標間的關系，對8個指標進行相關性分析，結果如表3所示，相對發芽率與相對發芽指數和相對活力指數之間存在極顯著的正相關關系（P＜0.01），說明15% PEG 6000脅迫處理條件下，綠豆資源的發芽率越高，其活力指數和鮮質量越高，發芽狀態愈佳；相對活力指數分別與相對發芽指數和相對根長呈極顯著的正相關關系（P＜0.01），說明種子活力高，發芽力強的綠豆資源，其根系伸長力較強；可溶性蛋白作為滲透調節物質[31]，干旱脅迫初期，可溶性蛋白大量產生，響應干旱造成的滲透脅迫，可溶性蛋白和相對活力指數存在顯著的負相關關系（P＜0.05），抗旱性資源中可溶性蛋白的上升比例小于不抗旱資源，干旱環境會引起芽苗中的可溶性蛋白含量上升，干旱脅迫越嚴重MDA含量越大。

2.3 40份綠豆資源的抗旱性綜合評價

基于相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數、相對胚根長、相對活力指數和相對鮮質量共6個指標，利用隸屬函數法，計算40份綠豆資源的抗旱性綜合得分D值，結果如表4所示，40份資源的綜合得分分布在0.07～0.08，平均值為0.38，變異系數為36%。當地主栽種（LD40）的D值為0.54，資源LD14、LD16和LD28的D值均大于LD40，其中最大值為0.70，最小值為0.59，說明該3份綠豆材料較榆綠1號具有更好的芽期抗旱性，可作為當地抗旱引種的潛在綠豆資源；其余36份綠豆資源的D值均小于LD40，D值的差異性反映了綠豆參試資源抗旱的多樣性。

表4 40份綠豆資源的抗旱性綜合評價Tab.4 Comprehensive evaluation of drought resistance for 40 mung bean resources

續表4 40份綠豆資源的抗旱性綜合評價Tab.4（Continued） Comprehensive evaluation of drought resistance for 40 mung bean resources

2.4 40份資源的抗旱性聚類分析結果

基于6個發芽和根長指標，計算歐氏距離，通過類平均法，對40份資源進行聚類分析，結果如圖1所示。

圖1 40份綠豆資源的抗旱性聚類分析結果Fig.1 Clustering dendrogram of drought-resistance for 40 mung bean resources

從圖1可以看出，40份綠豆資源科可劃分為四大類，其中，I類包含20份綠豆資源，主要為敏旱資源；II類由13份綠豆資源構成，主要包含一般抗旱性資源；III類涉及4份綠豆資源，抗旱水平中等；IV類為抗旱性材料，包含LD16、LD28和LD40，其中較對照抗旱性強的LD16和LD28資源均來源于吉林省。

2.5 PEG脅迫對綠豆資源MDA和可溶性蛋白含量的影響

MDA作為膜脂過氧化產物，它的產生還能加劇膜的損傷。因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性，大量積累會對綠豆芽苗造成損傷[32]。15% PEG處理后，各綠豆資源的MDA含量呈現上升趨勢，且40份綠豆資源的增長比例差異性顯著。從圖2可以看出，干旱處理后，LD20的MDA含量顯著性上升，增加至對照的1 037倍，LD17的MDA含量上升455倍，其余資源的MDA含量增加量集中在20倍以內。可溶性蛋白是植物應對滲透脅迫的重要調節物質和營養物質[23]，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質以及生物膜起到保護作用，因此，經常用作篩選抗性的指標之一。干旱脅迫6 d后，LD09的可溶性蛋白含量上升至對照的18倍，增幅顯著性高于其他資源，LD38的可溶性蛋白含量變化最小，為對照的0.95倍。

圖2 PEG處理后40份綠豆資源的MDA和RSP含量Fig.2 MDA and RSP contents of 40 mung bean resources after PEG treatment

3 結論與討論

干旱脅迫作為旱區綠豆種植的限制因子，利用不同濃度PEG模擬室內干旱處理，成為研究不同綠豆芽期抗旱性的重要方法[13]。發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數均體現了種子的活力，種子的質量會直接影響生育期抗旱性，可溶性蛋白的增加能夠提高細胞的保水能力，可對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用。因此，常作為篩選抗性的指標，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產物，MDA從膜上產生的位置釋放出后，可以與蛋白質、核酸反應，從而使之喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松弛，或抑制蛋白質的合成。因此，MDA的積累可能對膜和細胞造成一定的傷害。可通過MDA的含量反映膜系統受損程度以及植物的抗逆性。綜合這些指標能夠對40份綠豆資源做出抗旱性評價。

作物種子萌發期的抗旱性是一個復雜的數量性狀，是會受到多種因素的協同作用，作物的單項指標對抗旱性的評價貢獻是不同的，鑒于作物抗旱性的復雜度，單一指標不能客觀反映各綠豆資源的抗旱性[20,33]，因此，需要結合統計方法來對其抗旱性進行綜合性評價。作物抗旱性評價方法常用的隸屬函數、主成分分析、聚類分析和灰色關聯分析等方法進行綜合評價,本研究利用變異系數相關分析, 發現發芽勢、相對活力指數、MDA和可溶性蛋白含量可作為萌發期抗旱性鑒定的重要指標。基于6個發芽相關指標進行聚類分析和隸屬函數計算，最終得到40份綠豆資源的抗旱性綜合排名。各綠豆資源單一指標反映的抗旱性和綜合抗旱性差異明顯，排名第一的綠豆資源LD28在干旱處理后，發芽率100%，鮮質量0.495 g/粒，均大于對照，但是其胚根長僅占對照的19.84%，說明該資源在15% PEG 6000處理下，胚根伸長受阻，但種子吸水能力加強，根系活力旺盛，隸屬函數法得出的抗旱評級與抗旱表型結果基本一致，和聚類分析結果也相對一致，說明利用隸屬函數法對多指標進行綜合分析，抗旱性鑒定的結果可靠性更高[34]。

大量研究表明，干旱處理后，抗旱植物的MDA含量上升幅度小，不抗旱植物的MDA積累，同時可溶性蛋白在脅迫處理一定階段大量產生[35-36]。本研究中，綠豆資源LD14、LD16、LD28和LD40的抗旱性最高，除LD16的MDA相對增加43.69倍，其余3份抗旱性資源的MDA含量升幅均在10倍內。LD20的抗旱性綜合排名最低，MDA含量上升1 000多倍，但是部分材料的MDA含量變化無明顯規律，同時4份抗旱綠豆資源的可溶性蛋白含量相對上升2.68～6.11倍，低于40份綠豆資源的平均值7.25倍，其他材料的可溶性蛋白含量與其抗旱性排名差異較大，該結果可能與脅迫處理的濃度、時間、各綠豆資源的物質產生及積累特性有關。因此，將本研究中的MDA和可溶性蛋白僅單獨分析，未合并計算隸屬函數值。

本研究結果表明，在15% PEG 6000濃度脅迫下，40份綠豆資源表現的抗旱性差異明顯。RGP和RVI的變異系數均達到69%，是發芽指標中篩選抗旱性資源的優良指標。綜合RGR、RGP、RGI、RRL、RVI和RFW指標，利用隸屬函數法及類平均法系統聚類，以MDA和可溶性蛋白含量變化為輔助指標，最終將40份綠豆資源按照抗旱性不同綜合評分，并分為4類，研究結果為綠豆的抗旱性育種奠定了理論和資源基礎。