基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討王燦輝教授健脾益胃湯的作用機制*

陳秀峰，張碧文，李 佳，沈中衛(wèi)

(無錫市第二中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214121)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮和腺體萎縮、黏膜變薄、黏膜肌層增厚并伴有腸上皮化生、不典型增生為特征的慢性炎癥性疾病[1]，國內(nèi)報道其發(fā)病率為18.89～36.39%[2-4]。CAG與胃癌、特別是腸型胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，其病理過程經(jīng)歷了正常胃黏膜-炎癥-萎縮-腸上皮化生-異型增生-癌等幾個階段[5]。我國CAG的癌變率為1.2%～7.1 %[6]。因此，有效的治療和控制CAG被認為是胃癌早期預(yù)防的重點。全國著名中醫(yī)學(xué)家，南京中醫(yī)藥大學(xué)王燦暉教授從事中醫(yī)臨床、科研、教學(xué)工作60余載，學(xué)術(shù)造詣精深，臨證經(jīng)驗豐富，在辨治CAG方面具有豐富經(jīng)驗。陳瑩瑩等[7]對王燦暉教授診治的114例CAG病例分析發(fā)現(xiàn)脾胃虛弱證為常見證型之一，又將王燦暉教授診治的124例CAG病例分析發(fā)現(xiàn)健脾益胃湯為最常用方之一[8]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對健脾益胃湯治療脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎的作用進行分析，預(yù)測其潛在作用機制，為今后新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 健脾益胃湯主要成分的篩選及作用靶點預(yù)測 將健脾益胃湯藥物名稱(太子參、白術(shù)、茯苓、石斛、山藥、枳殼、厚樸、黃芩、仙鶴草、白花蛇舌草、莪術(shù))輸入計算系統(tǒng)生物學(xué)實驗室(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，使用口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)大于等于30%和藥物相似性(Drug-likeness，DL)大于等于0.2的限制條件篩選以獲得健脾益胃湯所有藥物的主要化學(xué)成分。將主要化學(xué)成分的“PubChen CId”輸入到PubChen數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，得到化學(xué)成分的“Canonical SMILES”信息，然后將其成分的“Canonical SMILES”信息輸入到SwissTarget Prediction平臺(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，物種選擇“人類(Homo Sapiens)”，預(yù)測健脾益胃湯化學(xué)成分的靶點。若主要化學(xué)成分無“PubChen CId”，則將TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“Related targets”中的靶蛋白導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)，得到其靶點，最后綜合兩者，去除重復(fù)，即可得到健脾益胃湯的潛在作用靶點信息。

1.2 檢索慢性萎縮性胃炎的疾病靶點 使用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM：http：//www.omim.org/)、Gene cards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)2個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，以檢索詞“chronic atrophic gastritis”進行檢索，收集獲得與慢性萎縮性胃炎相關(guān)的疾病靶點，將慢性萎縮性胃炎的靶點與1.1中健脾益胃湯主要成分的靶點進行比對，利用venny軟件取兩者交集，并得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用靶點信息。

1.3 制作“藥物-化學(xué)成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 利用1.1和1.2的結(jié)果，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-化學(xué)成分-潛在作用靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。明確單味藥物有哪些成分、這些成分治療慢性萎縮性胃炎的靶點是什么，初步探討健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制。

1.4 潛在作用靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/Version 11.0)。限定研究物種為人類，獲得蛋白互作關(guān)系圖，并將其保存為TSV格式。將該TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用Cytoscape軟件中的“MCODE”功能進行網(wǎng)絡(luò)分析，得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎蛋白互作最密切的基因集群。

1.5 蛋白互作最密切的基因集群的富集分析 將蛋白互作最密切的基因集群導(dǎo)入Metascape平臺(http：//metascape.org/)的“Step1”，點擊Submit，在“Step2”選項“Input as species”和“Analysis as species”中均選擇“人類(Homo Sapiens)”，在“Step3”中點擊“Express Analysis”進行富集分析，包括KEGG Pathway(KEGG通路)、WikiPathways(Wiki通路)、GO Biological Processes(生物過程富集分析)、Reactome Gene Sets(反應(yīng)組基因集)等。最后顯示前20個集群的分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 健脾益胃湯化學(xué)成分及潛在作用靶點預(yù)測 健脾益胃湯化學(xué)成分按照OB≥30%，DL≥0.2的條件進行篩選，一共獲得個97個化學(xué)成分。其中太子參8個，白術(shù)7個，茯苓15個，石斛15個，山藥15個，枳殼5個，厚樸2個，黃芩15個，仙鶴草5個，白花蛇舌草7個，莪術(shù)3個。去除重復(fù)及暫無作用靶點的成分，得到63個潛在化學(xué)成分，結(jié)果見(表1)。

表1 健脾益胃湯的63個化學(xué)成分信息

這63個化學(xué)成分中有50個成分從PubChen數(shù)據(jù)庫中獲取到了“Canonical SMILES”信息，然后將50個成分的“Canonical SMILES”信息輸入到SwissTarget Prediction平臺，物種選擇“人類(Homo Sapiens)”，得到潛在作用靶點6316個。剩余的13個主要成分無“Canonical SMILES”信息的，則提取TCMSP數(shù)據(jù)庫的靶蛋白，共82個，將82個靶蛋白導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)的靶基因。最后綜合兩者，去重后共獲得800個靶點信息。

2.2 慢性萎縮性胃炎的疾病靶點 檢索OMIM、Gene cards數(shù)據(jù)庫，得到CAG的422個靶點。利用venny軟件取兩者交集，得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的潛在作用靶點109個，詳見圖1。109個靶點類型數(shù)據(jù)利用 SPSS23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到109個作用靶點類型的頻數(shù)分析結(jié)果，詳見圖2。

圖1 藥物與疾病靶點交集

圖2 靶點類型頻率分析

從圖2可以看出健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的靶點類型有25種，包含各種酶(酶、激酶、蛋白酶、氧化還原酶、水解酶、連接酶、轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、裂解酶)、受體(G蛋白偶聯(lián)受體家族、核受體、膜受體、初級活性轉(zhuǎn)運體、家族bg蛋白偶聯(lián)受體、cg蛋白偶聯(lián)受體家族)、蛋白(分泌蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白家族、未分類蛋白)、離子通道(電壓門控離子通道、配體門控電子通道)、轉(zhuǎn)錄因子、電化學(xué)轉(zhuǎn)運體、跨膜單電子轉(zhuǎn)移載體、細胞色素P450等。其中Kinase(激酶)、Protease(蛋白酶)、Enzyme(酶)、Unclassified protein(未分類蛋白質(zhì))、Secreted protein(分泌蛋白)、Family A G protein-coupled receptor(G蛋白偶聯(lián)受體家族)、Transcription factor(轉(zhuǎn)錄因子)最多見。

2.3 制作“藥物-化學(xué)成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 利用2.1和2.2得到的結(jié)果，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在作用靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果詳見下圖3。

圖3 “藥物一化學(xué)成分一潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3中共涉及197個節(jié)點(nodes)、1214條邊(edges)。圖3中外圓英文代表潛在作用靶點，內(nèi)圓英文代表化學(xué)成分，中間中文代表中藥。其中197個節(jié)點(nodes)代表健脾益胃湯的單味藥物種類、化學(xué)成分、潛在作用靶點，1214條邊(edges)代表藥物與化學(xué)成分、化學(xué)成分與潛在作用靶點之間有聯(lián)系，展現(xiàn)健脾益胃湯的單味藥物有哪些化學(xué)成分，單一化學(xué)成分有哪些潛在作用靶點。圖3結(jié)果顯示β谷甾醇、刺槐素、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、16α-羥基松苓新酸，木犀草素，豆甾醇等7個化學(xué)成分均能與30個及以上靶點連接，可被認為是健脾益胃湯的主要化學(xué)成分。圖3結(jié)果顯示109個潛在作用靶點中AR、NOS2、ALOX5、MMP2、MMP3、SRC、CYP17A1、、MDM2、PPARg，PTGS2、CYP51A1、TERT、VDR、EGFR、G6PD、MET、MMP9、MMP12、PTPN11、ALK、MAPK1等靶點均與20種及以上成分相連，表明這些靶點在整個網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要的地位，說明這些靶點對健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎具有重要的意義。健脾益胃湯的同一化學(xué)成分可作用于不同的靶點，不同的化學(xué)成分也可以作用于相同的靶點，體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。

2.4 109個潛在作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將健脾益胃湯治療CAG的109個作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫。限定研究物種為人類，獲得蛋白互作關(guān)系圖(詳見下圖4)，并將其保存為TSV文件，將該TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，進行網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系最密切的基因集群，包含45個節(jié)點(nodes)和816條邊(edges)。這45個節(jié)點(nodes)代表45個靶點，若兩個靶點之間存在相互作用，則用邊(edges)作為連線將兩者連接起來，邊(edges)越多，代表蛋白質(zhì)相互作用越密切。這45個靶點可能對健脾益胃湯治療CAG其關(guān)鍵作用。

圖4 109個靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 蛋白互作最密切的45個靶點基因的富集分析 將45個靶基因?qū)隡etascape進行富集分析，最后結(jié)果顯示前20個集群，詳見下表2。其中KEGG通路分析包含：癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖通路、腫瘤壞死因子信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗等通路；Wiki通路有：AGE-RAGE信號通路、光動力療法誘導(dǎo)NF-kB存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)13個靶點、光動力療法誘導(dǎo)AP-1存活信號、NFKB(配體)受體激活劑信號通路；生物過程富集分析有：氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路、白細胞分化、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對氧氣水平的反應(yīng)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、對機械刺激的反應(yīng)、活性氧代謝過程；反應(yīng)組基因集有：白介素信號等。

表2 45個靶基因的前20個富集分析結(jié)果

3 討論

健脾益胃湯是王燦暉教授治療脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎的經(jīng)驗方。臨床療效顯著，然其療效作用與其組方的中藥傳統(tǒng)功效理論及辨病用藥的藥理作用相關(guān)，但其對慢性萎縮性胃炎的現(xiàn)代藥理學(xué)機制沒有得到系統(tǒng)的闡釋。

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到健脾益胃湯的63個化學(xué)成分，部分成分的有效性也以證實。β谷甾醇具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[9]，能抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡[10]。刺槐素通過激活Fas通路抑制胃癌AGS細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[11]。豆甾醇有抗炎、抗氧化作用[12]，還可以上調(diào)促凋亡基因BAX蛋白的表達、下調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達、抑制癌細胞的增殖，還能抑制胃癌細胞遷移，誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G2 / M期，抑制JAK / STAT信號通路[13]。去氫茯苓酸、去氫土莫酸是茯苓三萜類化合物的主要藥效組分[14]，三砧類化合物通過抑制一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶等的表達，抑制TNF-a，IL-1，PGE2，NO，IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[15]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[16]，可在多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)抗腫瘤。其機制包括預(yù)防腫瘤形成，抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生成以及增敏抗癌藥物活性等[17]。健脾益胃湯的這些化學(xué)成分通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、防癌、抗癌等作用治療慢性萎縮性胃炎。

從檢索的109個靶點類型看，109個作用靶點類型包含各種酶、受體、蛋白、離子通道、轉(zhuǎn)錄因子、電化學(xué)轉(zhuǎn)運體、跨膜單電子轉(zhuǎn)移載體、細胞色素P450等，表明健脾益胃湯的潛在靶點參與了生物代謝的各個部分。通過構(gòu)建藥物-化學(xué)成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)和潛在靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)這些靶點不僅可以單獨發(fā)揮作用，也可以通過相互調(diào)節(jié)、相互促進共同發(fā)揮作用，表明健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎具有多成分、多靶點、相互協(xié)調(diào)的作用特點，這也體現(xiàn)了方劑配伍的真諦。

從45個靶點的富集分析結(jié)果看。AGE-RAGE信號通路激活NF-kB核轉(zhuǎn)錄因子，可引起大量促炎細胞因子(如白細胞介素-6、白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-a)等的表達和釋放，最終引起慢性細胞活化和組織損傷，同時激活的NF-kB也會進一步增強RAGE的表達從而重復(fù)該過程，加重病情[18-19]。AP-1是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與胃癌的發(fā)生相關(guān)[20]。AP-1可促進多種炎癥因子(如IL 2，IL-8，TNF-a，TGF-β，IFN-y等)的表達，進而影響細胞的生理功能、參與疾病的發(fā)生。AP-1家族成員c-Jun，c-Fos屬于編碼核蛋白的原癌基因，原癌基因的過度激活可導(dǎo)致細胞癌變。富集分析顯示健脾益胃湯參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路、白細胞分化、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、氧氣水平的反應(yīng)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、對機械刺激的反應(yīng)、活性氧代謝過程、白介素信號等生物過程，通過改善胃黏膜細胞功能及抗氧化能力，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，達到治愈CAG的目的。基于KEGG代謝通路的分析結(jié)果顯示，健脾益胃湯治療CAG還與相關(guān)癌癥通路有關(guān)，通過相關(guān)癌癥通路參與胃癌細胞凋亡從而起到預(yù)防胃癌的發(fā)生。