銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸的樹脂柱分離工藝研究

黃莉清，蘇嬌嬌，王黔陽，彭麗娟，何珺

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 煙草學院，貴州 貴陽 550025)

我國銀杏資源約占全世界總量的75%，其中銀杏葉產量占世界總產量90%以上[1-2]，銀杏葉提取物市場藥用價值極高[3-5]。銀杏葉提取物每年生產中產生廢棄提取粘渣約2 000 t，其中銀杏酚酸含量約為17%，近300 t銀杏酚酸排廢丟棄，會引起污染環境人或畜中毒[6-7]。

銀杏酚酸具有抗腫瘤、抑菌、殺蟲等活性[8-9]。銀杏葉中銀杏酚酸的相關研究正逐年上升[10]，集中在其脫除研究[11-12]，對銀杏酚酸的提純再利用較少。本文以銀杏葉生產提取物醇提液濃縮加水靜置沉淀產生水沉的廢渣為原料，研究HPD-5000型大孔樹脂純化銀杏酚酸的工藝，回收純化銀杏酚酸組分，對銀杏資源的綜合利用及環境保護具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

銀杏葉提取物生產水沉廢渣，于2022年 1月 12 號取自貴州北極興藥業有限公司；對照品白果新酸(批號111594-20160)由中檢院提供；HPD-5000、LX-60、D101、AB-8、DM130、DA201均由西安藍曉科技材料股份有限公司提供；無水乙醇、甲醇、石油醚(60-90)、三氟乙酸均為分析純；乙腈，色譜級；娃哈哈水(貴陽娃哈哈昌盛飲料有限公司)。

LC-2040C 3D超高效液相色譜儀；KQ3200DE數控超聲波清洗器；BSA1245電子天平；HH-1水浴加熱鍋。

1.2 銀杏酚酸HPLC含量測定

1.2.1 HPLC測定色譜條件 色譜柱：Supersil-U C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%三氟乙酸水(0 min 75∶25→30 min 90∶10→35 min 90∶10→35.5 min 75∶25→38 min 75∶25)，檢測波長310 nm，進樣量50 μL，柱溫45 ℃，流速 1 mL/min，分析時間40 min。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定適量白果新酸對照品，置于容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，定容，搖勻，配制成質量濃度為3.44 μg/mL銀杏酚酸的對照品溶液。

1.2.3 白果新酸標準曲線的制作 精密吸取白果新酸對照品溶液1，2，2.5，5，10 mL，加入甲醇定容至10 mL，振蕩均勻后按1.2.1節HPLC色譜條件進行分析，以白果新酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為：y=34 959x+4 051.6，R2=0.998 2，表明白果新酸濃度范圍在0.334～3.44 μg/mL時有良好的線性相關性。

1.2.4 供試品含量測定 精密稱取0.01 g置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，搖勻，得供試品。按1.2.1節進行檢測分析，得HPLC色譜圖見圖1、圖2。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

圖2 純化產品色譜圖Fig.2 Chromatogram of purified product

1.3 銀杏酚酸大孔樹脂分離工藝篩選

1.3.1 樹脂預處理 將HPD-5000、LX-60、AB-8、DM130、DA201 五種型號樹脂用5% NaOH浸泡 3～5 h，水洗至中性，再用5% 鹽酸浸泡3～5 h，水洗至中性，70%乙醇溶液平衡樹脂，備用。

1.3.2 銀杏酚酸上柱原料液制備 取100 g銀杏葉提取物生產水沉渣作為原料，用料液比為1∶2甲醇攪拌溶解，離心去不溶沉淀后，加200 mL石油醚萃取，補適量水使分層明顯后，取石油醚層濃縮為萃取浸膏。再采用70%乙醇溶解萃取浸膏得銀杏酚酸上柱液。

2 結果與討論

2.1 靜態吸附實驗

稱取預處理后的樹脂各5 g，分別置于三角瓶中，各添加50 mL 2.308 5 mg/mL銀杏酚酸原料液，置25 ℃恒溫、180 r/min搖床振蕩吸附24 h，使銀杏酚酸充分吸收；濾過，吸干樹脂表面水分，加入95%乙醇，各70 mL，25 ℃恒溫、180 r/min搖床振蕩解析 24 h，使銀杏酚酸充分解吸。檢測濾液和洗脫液中銀杏酚酸的含量，并計算飽和吸附量和解析率，吸附率=(銀杏酚酸吸附量/上樣液中銀杏酚酸總量)×100%，解析率=(銀杏酚酸解吸附量/銀杏酚酸吸附量)×100%，結果見表1。

表1 銀杏酚酸不同大孔樹脂的靜態吸附和 解析性能(n=2)Table 1 Static adsorption and analytical properties of different macroporous resins of ginkgolic acid

由表1可知，DA201樹脂的吸附率及純度最高，其次是HPD-5000及DM130。但由于銀杏葉提取物工業生產中常用HPD-5000脫酸、DM130吸附黃酮，因此綜合工業生產現有條件及成本消耗等角度考慮，選用HPD-5000進行深入研究。

2.2 上樣流速的篩選

取30 mL HPD-5000樹脂3份濕法裝柱，分別裝入相同規格的層析柱中，各取200 mL 2.226 7 mg/mL銀杏酚酸原料液，并各以1，2，3 BV/h 的流速上樣，分別收集3份上樣流出液并測定其銀杏酚酸含量，結果見圖3。

圖3 不同上樣流速吸附結果Fig.3 Adsorption results at different samples flow rate

由圖3可知，隨著上樣流速的加快，流出液中的銀杏酚酸含量越多，目標物丟失越大，大孔樹脂吸附效果越差。因此，綜合考慮選擇上樣流速為1 BV/h。

2.3 洗脫劑乙醇濃度篩選

取100 mL HPD-5000樹脂濕法裝柱，160 mL銀杏酚酸原料液1 BV/h上柱，2 BV 70%乙醇除雜，依次用3 BV 75%，80%，90%乙醇洗脫，收集不同濃度洗脫液，濃縮為浸膏并測定銀杏酚酸含量，結果見圖4。

由圖4可知，70%乙醇中幾乎不含銀杏酚酸，90%乙醇洗脫劑中富集大量銀杏酚酸，因此選擇乙醇濃度為70%乙醇除雜，90%乙醇為洗脫劑。

圖4 不同濃度乙醇洗脫液洗脫結果Fig.4 Elution results of different concentrations of ethanol eluent

2.4 洗脫劑用量的篩選

取100 mL HPD-5000樹脂濕法裝柱，160 mL銀杏酚酸原料液1 BV/h上柱，2 BV 70%乙醇除雜，用90%乙醇洗脫，每100 mL收集1份洗脫液，檢測每份洗脫液中銀杏酚酸含量，結果見圖5。

圖5 洗脫劑用量篩選結果Fig.5 Screening results of eluent dosage

由圖5可知，第2 BV流份的銀杏酚酸洗脫量達到最高，當接到第4 BV時銀杏酚酸量開始極少，從成本及純度等角度綜合考慮，確定選用4 BV 90%乙醇為最佳洗脫劑用量。

2.5 樹脂最佳徑高比的篩選

取3根不同規格的層析柱，使相同體積大孔樹脂濕法裝柱后徑高比分別為1∶4，1∶6，1∶8，取相同濃度相同體積銀杏酚酸原料液，1 BV/h上樣，2 BV 70%乙醇除雜，4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋干為浸膏測銀杏酚酸含量，結果見圖6。

圖6 樹脂徑高比篩選結果Fig.6 Screening results of resin diameter-to-height ratio

由圖6可知，當徑高比為1∶6和1∶8時銀杏酚酸含量都較高，但從成本及效果綜合考慮，確定1∶6為最佳樹脂徑高比。

2.6 銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸HPD-5000樹脂分離工藝驗證

精密稱取3份100 g銀杏葉提取物廢渣，用甲醇料液比為1∶12，溫度40 ℃，加熱回流提取 90 min，濃縮提取液得到銀杏酚酸提取浸膏。用 200 mL 熱水溶解提取浸膏，按料液比1∶2加入乙酸乙酯萃取2次濃縮得到銀杏酚酸萃取浸膏。用70%乙醇溶解萃取浸膏得銀杏酚酸上柱液。分別精密量取200 mL HPD-5000樹脂，濕法裝柱到徑高比為1∶6 的層析柱中，上樣流速為1 BV/h，2 BV 70%乙醇除雜，4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋干為浸膏測銀杏酚酸含量，相關數據見表2、表3。

表2 銀杏酚酸提純工藝驗證(n=3)Table 2 Validation of ginkgolic acid purification process

表3 銀杏酚酸提純含量驗證(n=3)Table 3 Validation of purified content of ginkgolic acid

由表2、表3可知，3次平行驗證實驗的RSD值為1.77%，小于2%，說明該銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸HPD-5000樹脂分離工藝驗證重復性好，工藝穩定可行。

3 結論

本文以銀杏葉提取物生產過程中產生的水沉廢渣為原料，采用大孔吸附樹脂方法分離純化工藝研究。對HPD-5000、LX-60、AB-8、DM130、DA201 5種型號樹脂進行靜態吸附實驗，綜合考察，選用HPD-5000型樹脂作為銀杏葉提取物廢渣中分離銀杏酚酸的吸附樹脂。確定分離純化工藝為：以HPD-5000型樹脂為柱層析樹脂，上樣流速1 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為70%除雜、90%洗脫，90%乙醇洗脫劑體積為4 BV，樹脂徑高比1∶6。該工藝可以將銀杏葉提取物廢渣中17%銀杏酚酸含量有效提升至77.87% 。

銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸的提取工藝目前相關報道極少，本實驗采用大孔吸附樹脂的方法對銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸進行分離純化，結果顯示大孔樹脂純化后銀杏酚酸富集效果明顯。該工藝操作簡單，周期短，樹脂可重復利用，有利于銀杏葉藥材資源綜合開發利用及生產。