銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸的樹脂柱分離工藝研究

黃莉清，蘇嬌嬌，王黔陽(yáng)，彭麗娟，何珺

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

我國(guó)銀杏資源約占全世界總量的75%，其中銀杏葉產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量90%以上[1-2]，銀杏葉提取物市場(chǎng)藥用價(jià)值極高[3-5]。銀杏葉提取物每年生產(chǎn)中產(chǎn)生廢棄提取粘渣約2 000 t，其中銀杏酚酸含量約為17%，近300 t銀杏酚酸排廢丟棄，會(huì)引起污染環(huán)境人或畜中毒[6-7]。

銀杏酚酸具有抗腫瘤、抑菌、殺蟲等活性[8-9]。銀杏葉中銀杏酚酸的相關(guān)研究正逐年上升[10]，集中在其脫除研究[11-12]，對(duì)銀杏酚酸的提純?cè)倮幂^少。本文以銀杏葉生產(chǎn)提取物醇提液濃縮加水靜置沉淀產(chǎn)生水沉的廢渣為原料，研究HPD-5000型大孔樹脂純化銀杏酚酸的工藝，回收純化銀杏酚酸組分，對(duì)銀杏資源的綜合利用及環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

銀杏葉提取物生產(chǎn)水沉廢渣，于2022年 1月 12 號(hào)取自貴州北極興藥業(yè)有限公司；對(duì)照品白果新酸(批號(hào)111594-20160)由中檢院提供；HPD-5000、LX-60、D101、AB-8、DM130、DA201均由西安藍(lán)曉科技材料股份有限公司提供；無(wú)水乙醇、甲醇、石油醚(60-90)、三氟乙酸均為分析純；乙腈，色譜級(jí)；娃哈哈水(貴陽(yáng)娃哈哈昌盛飲料有限公司)。

LC-2040C 3D超高效液相色譜儀；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器；BSA1245電子天平；HH-1水浴加熱鍋。

1.2 銀杏酚酸HPLC含量測(cè)定

1.2.1 HPLC測(cè)定色譜條件 色譜柱：Supersil-U C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%三氟乙酸水(0 min 75∶25→30 min 90∶10→35 min 90∶10→35.5 min 75∶25→38 min 75∶25)，檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm，進(jìn)樣量50 μL，柱溫45 ℃，流速 1 mL/min，分析時(shí)間40 min。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定適量白果新酸對(duì)照品，置于容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為3.44 μg/mL銀杏酚酸的對(duì)照品溶液。

1.2.3 白果新酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密吸取白果新酸對(duì)照品溶液1，2，2.5，5，10 mL，加入甲醇定容至10 mL，振蕩均勻后按1.2.1節(jié)HPLC色譜條件進(jìn)行分析，以白果新酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=34 959x+4 051.6，R2=0.998 2，表明白果新酸濃度范圍在0.334～3.44 μg/mL時(shí)有良好的線性相關(guān)性。

1.2.4 供試品含量測(cè)定 精密稱取0.01 g置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，搖勻，得供試品。按1.2.1節(jié)進(jìn)行檢測(cè)分析，得HPLC色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

圖2 純化產(chǎn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of purified product

1.3 銀杏酚酸大孔樹脂分離工藝篩選

1.3.1 樹脂預(yù)處理 將HPD-5000、LX-60、AB-8、DM130、DA201 五種型號(hào)樹脂用5% NaOH浸泡 3～5 h，水洗至中性，再用5% 鹽酸浸泡3～5 h，水洗至中性，70%乙醇溶液平衡樹脂，備用。

1.3.2 銀杏酚酸上柱原料液制備 取100 g銀杏葉提取物生產(chǎn)水沉渣作為原料，用料液比為1∶2甲醇攪拌溶解，離心去不溶沉淀后，加200 mL石油醚萃取，補(bǔ)適量水使分層明顯后，取石油醚層濃縮為萃取浸膏。再采用70%乙醇溶解萃取浸膏得銀杏酚酸上柱液。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱取預(yù)處理后的樹脂各5 g，分別置于三角瓶中，各添加50 mL 2.308 5 mg/mL銀杏酚酸原料液，置25 ℃恒溫、180 r/min搖床振蕩吸附24 h，使銀杏酚酸充分吸收；濾過(guò)，吸干樹脂表面水分，加入95%乙醇，各70 mL，25 ℃恒溫、180 r/min搖床振蕩解析 24 h，使銀杏酚酸充分解吸。檢測(cè)濾液和洗脫液中銀杏酚酸的含量，并計(jì)算飽和吸附量和解析率，吸附率=(銀杏酚酸吸附量/上樣液中銀杏酚酸總量)×100%，解析率=(銀杏酚酸解吸附量/銀杏酚酸吸附量)×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 銀杏酚酸不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附和 解析性能(n=2)Table 1 Static adsorption and analytical properties of different macroporous resins of ginkgolic acid

由表1可知，DA201樹脂的吸附率及純度最高，其次是HPD-5000及DM130。但由于銀杏葉提取物工業(yè)生產(chǎn)中常用HPD-5000脫酸、DM130吸附黃酮，因此綜合工業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)有條件及成本消耗等角度考慮，選用HPD-5000進(jìn)行深入研究。

2.2 上樣流速的篩選

取30 mL HPD-5000樹脂3份濕法裝柱，分別裝入相同規(guī)格的層析柱中，各取200 mL 2.226 7 mg/mL銀杏酚酸原料液，并各以1，2，3 BV/h 的流速上樣，分別收集3份上樣流出液并測(cè)定其銀杏酚酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同上樣流速吸附結(jié)果Fig.3 Adsorption results at different samples flow rate

由圖3可知，隨著上樣流速的加快，流出液中的銀杏酚酸含量越多，目標(biāo)物丟失越大，大孔樹脂吸附效果越差。因此，綜合考慮選擇上樣流速為1 BV/h。

2.3 洗脫劑乙醇濃度篩選

取100 mL HPD-5000樹脂濕法裝柱，160 mL銀杏酚酸原料液1 BV/h上柱，2 BV 70%乙醇除雜，依次用3 BV 75%，80%，90%乙醇洗脫，收集不同濃度洗脫液，濃縮為浸膏并測(cè)定銀杏酚酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，70%乙醇中幾乎不含銀杏酚酸，90%乙醇洗脫劑中富集大量銀杏酚酸，因此選擇乙醇濃度為70%乙醇除雜，90%乙醇為洗脫劑。

圖4 不同濃度乙醇洗脫液洗脫結(jié)果Fig.4 Elution results of different concentrations of ethanol eluent

2.4 洗脫劑用量的篩選

取100 mL HPD-5000樹脂濕法裝柱，160 mL銀杏酚酸原料液1 BV/h上柱，2 BV 70%乙醇除雜，用90%乙醇洗脫，每100 mL收集1份洗脫液，檢測(cè)每份洗脫液中銀杏酚酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 洗脫劑用量篩選結(jié)果Fig.5 Screening results of eluent dosage

由圖5可知，第2 BV流份的銀杏酚酸洗脫量達(dá)到最高，當(dāng)接到第4 BV時(shí)銀杏酚酸量開(kāi)始極少，從成本及純度等角度綜合考慮，確定選用4 BV 90%乙醇為最佳洗脫劑用量。

2.5 樹脂最佳徑高比的篩選

取3根不同規(guī)格的層析柱，使相同體積大孔樹脂濕法裝柱后徑高比分別為1∶4，1∶6，1∶8，取相同濃度相同體積銀杏酚酸原料液，1 BV/h上樣，2 BV 70%乙醇除雜，4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋干為浸膏測(cè)銀杏酚酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 樹脂徑高比篩選結(jié)果Fig.6 Screening results of resin diameter-to-height ratio

由圖6可知，當(dāng)徑高比為1∶6和1∶8時(shí)銀杏酚酸含量都較高，但從成本及效果綜合考慮，確定1∶6為最佳樹脂徑高比。

2.6 銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸HPD-5000樹脂分離工藝驗(yàn)證

精密稱取3份100 g銀杏葉提取物廢渣，用甲醇料液比為1∶12，溫度40 ℃，加熱回流提取 90 min，濃縮提取液得到銀杏酚酸提取浸膏。用 200 mL 熱水溶解提取浸膏，按料液比1∶2加入乙酸乙酯萃取2次濃縮得到銀杏酚酸萃取浸膏。用70%乙醇溶解萃取浸膏得銀杏酚酸上柱液。分別精密量取200 mL HPD-5000樹脂，濕法裝柱到徑高比為1∶6 的層析柱中，上樣流速為1 BV/h，2 BV 70%乙醇除雜，4 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋干為浸膏測(cè)銀杏酚酸含量，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、表3。

表2 銀杏酚酸提純工藝驗(yàn)證(n=3)Table 2 Validation of ginkgolic acid purification process

表3 銀杏酚酸提純含量驗(yàn)證(n=3)Table 3 Validation of purified content of ginkgolic acid

由表2、表3可知，3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的RSD值為1.77%，小于2%，說(shuō)明該銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸HPD-5000樹脂分離工藝驗(yàn)證重復(fù)性好，工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

本文以銀杏葉提取物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的水沉廢渣為原料，采用大孔吸附樹脂方法分離純化工藝研究。對(duì)HPD-5000、LX-60、AB-8、DM130、DA201 5種型號(hào)樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，綜合考察，選用HPD-5000型樹脂作為銀杏葉提取物廢渣中分離銀杏酚酸的吸附樹脂。確定分離純化工藝為：以HPD-5000型樹脂為柱層析樹脂，上樣流速1 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為70%除雜、90%洗脫，90%乙醇洗脫劑體積為4 BV，樹脂徑高比1∶6。該工藝可以將銀杏葉提取物廢渣中17%銀杏酚酸含量有效提升至77.87% 。

銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸的提取工藝目前相關(guān)報(bào)道極少，本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂的方法對(duì)銀杏葉提取物廢渣中銀杏酚酸進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示大孔樹脂純化后銀杏酚酸富集效果明顯。該工藝操作簡(jiǎn)單，周期短，樹脂可重復(fù)利用，有利于銀杏葉藥材資源綜合開(kāi)發(fā)利用及生產(chǎn)。