石墨烯碳量子點用于氟喹諾酮類抗生素的熒光檢測

李港，胡玉峰

(大連理工大學 海洋科學與技術學院，遼寧 盤錦 124221)

氟喹諾酮類抗生素(FQs)作為一種人畜共用的藥物被廣泛使用，然而進入人體或動物體內的FQs，70%未被代謝而通過排泄釋放到環境中，在我國水環境中常有痕量殘留[1]，因此建立針對FQs的快速檢測方法對于保證人類和環境健康具有重要意義。目前，抗生素的檢測方法主要有細菌分析法、化學儀器分析法、免疫分析法，但這些方法或操作復雜，或靈敏度不足，或僅能檢測特定目標物[2-6]。石墨稀碳量子點(GCDs) 因其生物相容性、發光性 (PL)以及分散性被廣泛運用到各個領域[7-8]。在FQs檢測方面有很大的潛力[9-10]。目前，水熱法是最常用的GCDs制備方法[11]。制備過程中所采用的原材料、反應條件等，對GCDs熒光性質及表面官能團種類具有很多影響[12-15]。

本研究擬通過對GCDs制備方法的優化，得到對FQs具有熒光響應的GCDs，并對其熒光特性進行表征，探索其作為熒光單體用于定量檢測FQs的可能性，為環境中FQs的快速篩查奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

過氧化氫(30%)、二氧化錳、氧化石墨烯(GO)均為分析級；氧氟沙星(OFL)，購自百靈威科技有限公司；恩諾沙星(ENR)、環丙沙星(CPR)，均由上海源業生物科技有限公司提供；諾氟沙星(NOR)，購自梯希愛(上海)發展有限公司；實驗用水為超純水。

F-7000熒光分光光度計；Tecnai G2F30透射電子顯微鏡(FEI)；UPTA-20超純水機。

1.2 GCDs的制備

將20 mg氧化石墨烯溶于20 mL超純水中，加入5 mL 30% H2O2溶液，超聲分散30 min。將混合物轉移至100 mL聚四氟乙烯內襯中，并置于高壓釜室中，在180 ℃ 下保持90 min，冷卻至室溫。用 0.2 μm 濾膜過濾，濾液轉移至透析袋(截留分子量3 500 Da)中。將適量的MnO2用超純水溶化后，投入另一個透析袋中，用作去除反應剩余過氧化氫的催化劑。把兩個透析袋封閉起來，一起放進裝有超純水的燒杯內，避光靜置。待燒杯中不再產生氣泡時，將裝有GCDs溶液的透析袋取出，用超純水沖洗透析袋表面，去除二氧化錳，透析袋中的液體即為制備的GCDs溶液，置于冰箱中冷藏待用。

1.3 GCDs的表征

使用熒光分光光度計在360 nm激發下獲得熒光光譜，其中光電管電壓為700 V，掃描速度為 1 200 nm/min，激發單元狹縫寬度設置為5.0 nm，發射單元狹縫寬度設置為5.0 nm。除特殊說明外，實驗過程中的熒光光譜獲取均為此參數設置。使用透射電子顯微鏡拍攝TEM圖像。

1.4 實驗方法

將1.2節中制備的GCDs溶液，冷藏避光保存，并定時定量取出，使用熒光分光光度計檢測其熒光強度，記錄其在120 min內的變化。

配制一系列濃度梯度為10%的GCDs溶液(10%～90%)，加入定量FQs，振蕩培養120 min，用熒光分光光度計檢測其熒光強度，記錄熒光強度的變化，并根據結果，分析GCDs用于FQs檢測時的最優條件。

在最優GCDs濃度與最優培養時間下，將GCDs用于多種FQs的定量檢測，繪制FQs濃度-F/F0標準曲線，計算GCDs對多種FQs的檢測限。

2 結果與討論

2.1 GCDs的制備

GCDs制備時的加熱時間對于材料的熒光性能有非常大的影響，實驗見圖1。

圖1 不同加熱時間制備的GCDs照片(a) 與熒光發射光譜圖(b)Fig.1 Physical diagram(a) and fluorescence emission spectrum(b) of GCDs at different heating time

由圖1可知，隨著加熱時間的增加，溶液顏色由深到淺，同時GCDs量子點熒光強度增加，在85 min時達到最大值，而當加熱時間繼續延長至90 min時，溶液則不再有熒光信號，這是因為該制備反應本質上是將微米級尺度的氧化石墨烯切割為納米級尺度的石墨烯碳量子點的過程。當加熱時間從70 min 增加到 90 min 時，獲得了一系列的產物，盡管實驗中已經通過濾膜去除了大尺度的殘留物，但還是有各種不同尺度的產物保留了下來，因此，這實際上是一個混合體系的熒光測量。作為原料的氧化石墨烯溶液為棕黃色，沒有任何熒光，加熱70 min 時，溶液仍保持棕黃色，但是主要表現出500 nm處的綠色熒光，加熱時間到85 min 時，溶液為淡黃色，并且 450 nm 處的藍色熒光也增強，加熱時間到達90 min 后，溶液為無色透明狀態，并且幾乎沒有任何熒光，這表明氧化石墨烯全部分解為了小分子物質，不再具有熒光性能。因此，確定GCDs最佳制備時間為85 min。

圖2是GCDs的TEM圖。

圖2 GCDs的TEM圖(a、b)和尺寸分布(c)Fig.2 TEM diagram of GCDs and size distribution of GCDs a.20 nm；b.5 nm；c.GCDs尺寸分布

由圖2可知，GCDs尺寸分布比較均勻，集中在5～10 nm。由GCDs高分辨的表征，由圖2b可知，GCDs有明顯的晶格線條紋。通過多處取像，并對GCDs尺寸進行統計，由圖2c可知，GCDs尺寸集中在6～8 nm。

2.2 GCDs的穩定性

取10 mL GQDs溶液避光靜置，分別在0，10，20，30，45，60，90，120 min時，各取1 mL GQDs溶液置于熒光分光光度計中獲取熒光光譜，結果見表1。

表1 GCDs穩定性Table 1 Stability of GCDs

由表1可知，GCDs在120 min 內熒光強度幾乎不發生改變。后續研究中，實驗時間應控制在 120 min 內。

2.3 GCDs使用條件的優化

以諾氟沙星(NOR)作為氟喹諾酮類抗生素的代表物進行實驗。

2.3.1 GCDs的使用濃度 在10%～90%濃度范圍內，按照濃度梯度為10%(v/v)配制GCDs溶液各2份，并向其中1份加入NOR溶液，NOR在體系中的終濃度為100 μmol/L，振蕩培養15 min后，測量體系的熒光強度，結果見圖3。

由圖3可知，當存在NOR時，GCDs的熒光強度出現增強，當NOR濃度不變，GCDs濃度增加，則NOR對GCDs熒光增強的響應逐漸減弱。GCDs濃度為10%時，NOR對其的熒光增強效果最佳，但是此時GCDs的初始熒光強度較低，會導致熒光光譜儀數據測量的不準確性。當GCDs濃度為90%時，NOR對其的熒光增強效果最差，這是由于體系中GCDs的量遠高于NOR，從而導致增強效果減弱，不利于對NOR的檢測。因此，綜合兩者之后，后續實驗采用 50% 作為最優濃度使用。

圖3 不同濃度條件下GCDs-NOR體系的熒光強度變化Fig.3 Changes of fluorescence intensity of GCDS-NOR system at different concentration of GCDs

2.3.2 培育時間 配制含有GCDs(濃度為50%)、NOR(50 μmol/L)的混合溶液9份，并立即振蕩，分別于配制后1，5，10，15，30，45，60，90，120 min 時，測試各混合溶液的熒光光譜。同時采用濃度為50%的GCDs溶液作為對照，結果見圖4。

圖4 不同培育時間的GCDs-NOR體系熒光強度變化Fig.4 Changes of fluorescence intensity of GCDS-NOR system at different incubation time

由圖4可知，當GCDs用于NOR的檢測時，體系的熒光強度在1 min內即可達到最大值，且在 10 min 內維持不變，說明GCDs能夠非常快速地對諾氟沙星做出熒光響應，之后隨時間增加，熒光增強逐漸降低，并在45 min 之后基本保持穩定。因此，為便于操作和獲取更加穩定的熒光信號，在后續實驗中均采用10 min作為培育時間。

2.4 GCDs用于氟喹諾酮類抗生素的檢測

配制濃度為0，5，10，15，20，30，40，50 μmol/L的NOR、OFL、ENR或CPR的溶液，按2.3節中的最優條件，與GCDs溶液混合，測定體系的熒光強度。測試條件如下：激發波長360 nm，發射波長范圍為380～700 nm，光電管電壓為700 V，掃描速度為 1 200 nm/min，激發單元狹縫為2.5 nm，發射單元狹縫5.0 nm。結果見圖5和圖6。

圖5 不同濃度的NOR、OFL、ENR和CPR存在時，GCDs溶液的熒光波譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of GCDs solution with different concentration of NOR，OFL，ENR and CPR a.NOR；b.OFL；c.ENR；d.CPR

由圖5可知，在濃度范圍為0～50 μmol/L時，4種氟喹諾酮類抗生素均對GCDs具有熒光增強效應，因此可以通過GCDs的熒光強度增加與否，判斷是否存在氟喹諾酮類抗生素。4種氟喹諾酮類抗生素對GCDs的熒光增強效應從強到弱為：ENR>CPR>NOR>OFL。同時，在OFL存在時，GCDs的熒光峰會發生紅移，而其他三種均未出現此情況，因此可以根據此現象將OFL與其它種類的氟喹諾酮類抗生素進行區分。

圖6 4種抗生素對GCDs熒光響應Fig.6 The fluorescence response of four fluoroquinolones on GCDs a.NOR；b.OFL；c.ENR；d.CPR

由圖6可知，GCDs對于4種喹諾酮類抗生素在0～50 μmol/L濃度下均表現出穩定的線性熒光增強響應，因此，GCDs可以用于喹諾酮類抗生素濃度的定量檢測。相應的檢測限根據LOD=3S/K計算得到，其中，S為20次重復測試標準差，K為標準曲線斜率。采用GCDs對NOR、OFL、ENR、CPR 4種氟喹諾酮類抗生素在0～50 μmol/L濃度范圍內進行檢測時，檢測限分別為 1.305，2.178，0.753，1.035 nmol/L。宗婧婧等采用膠體金免疫層析法檢測水產品中氟喹諾酮類抗生素，檢測時間為3～5 min，恩諾沙星、環丙沙星等氟喹諾酮類抗生素的檢出限在0.3～5 μg/kg[16]；鄭晶等采用酶聯免疫吸附法快速檢測鰻魚中恩諾沙星殘留，測試檢測范圍為0.3～10 μg/kg，最低檢測線為3 μg/kg[17]；康莉等采用高效液相色譜-串聯質譜法檢測水產品中的氟喹諾酮類抗生素殘留分析方法，檢測范圍為0.20～5.00 mg/kg，檢測限為0.50～31.4 μg/kg[18]。與其他研究相比，本實驗所建立的基于GCDs熒光檢測氟喹諾酮類抗生素的方法在檢測范圍和檢測靈敏度上具有一定的優勢。

3 結論

(1)在石墨烯水溶液中加入過氧化氫，180 ℃加熱85 min，得到對氟喹諾酮類抗生素具有熒光響應的GCDs。在GCDs濃度為50%，培育時間為10 min的檢測條件下，對NOR、OFL、ENR、CPR 4種氟喹諾酮類抗生素在0～50 μmol/L濃度范圍內進行檢測時，檢測限分別為1.305，2.178，0.753，1.035 nmol/L。

(2)在OFL存在時，GCDs的熒光峰會發生紅移，而其他三種均未出現此情況，因此可以根據此現象將OFL與其它種類的氟喹諾酮類抗生素進行區分。