基于代謝組學的醬鹵鴨翅變質前后代謝物差異比較

李雪，羅芳，劉光憲*，王麗，程文龍，張耀

（1.江西省農業科學院農產品加工研究所，江西 南昌 330200；2.瑞金市農業農村局，江西 瑞金 342500）

醬鹵鴨肉制品是我國傳統醬鹵肉制品的典型代表，因其具有營養豐富、肉質筋道、鮮嫩誘人等特點，深受我國消費者喜愛[1-2]。但鴨肉中的蛋白質和脂肪含量豐富、水分活度高，易使其在運輸、儲藏和銷售過程中滋生腐敗微生物，嚴重影響產品品質。目前，對醬鹵鴨肉制品的研究主要集中在保鮮效果[3-4]、風味物質[5]以及加工工藝優化[6-7]等方面。而從代謝組學的角度，研究醬鹵鴨肉制品變質前后代謝產物的變化鮮見報道。

代謝組學是一種較新的食品質量評估工具，可用于食品安全、質量和可追溯性方面的研究[8-9]，包括靶向代謝組學和非靶向代謝組學，其中靶向代謝組學是針對樣本中特定一類代謝物的研究分析，而非靶向代謝組學是對樣本代謝物進行全面、系統的分析，是一種無偏向的代謝組學分析[10-12]。目前，代謝組學對肉品的研究主要集中在質量安全[13]、產地鑒別[14]、加工過程監控[15]等方面。Zhang等[16]利用代謝組學的方法研究了無骨干腌火腿加工過程中代謝物的變化，研究發現氨基酸（異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸）、有機酸（乳酸、醋酸、琥珀酸、檸檬酸和甲酸）和核苷酸衍生物（次黃嘌呤）是干腌火腿風味的主要組成成分。Jung等[17]采用代謝組學結合多元統計數理分析的方法，研究了4個不同國家市售牛肉的代謝產物，研究發現異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和纈氨酸存在顯著差異。Argyri等[18]利用代謝組學與多元統計學分析法，研究了牛肉糜在不同溫度和不同氣調包裝條件下的腐敗情況，發現有機酸可以評估肉類腐敗和微生物生長狀況。

目前，影響鴨肉制品腐敗變質的因素主要有3方面：微生物繁殖及其代謝產物、物理因素和化學因素。企業在肉制品加工過程中有嚴格的生產操作規范，使得物理因素和化學因素導致的腐敗變質能得到有效控制。所以，微生物繁殖及其代謝產物成為肉制品致腐的主導因素，微生物在生長繁殖過程中會產生各種酶，使蛋白質分解、脂肪水解以及碳水化合物被利用，生成一系列代謝產物。因此，本文以醬鹵鴨翅為原料，采用液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用非靶向代謝組學結合多元統計學分析技術，研究醬鹵鴨翅在13℃貯藏10 d后其差異代謝物變化情況，分析醬鹵鴨翅中腐敗微生物的代謝特征并揭示其腐敗機理，以期為延長肉制品貨架期和擴大銷售半徑提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬鹵鴨翅（氣調包裝）：市售。

甲醇、水、甲酸、醋酸銨（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

QE質譜儀、Vanquish UHPLC液相色譜儀、ST16R低溫離心機、Hyperil Gold column色譜柱：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數測定

氣調包裝醬鹵鴨翅產品置于13℃恒溫箱中貯藏，分別在 1、3、5、7、10 d 時參照國家標準 GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定儲藏期間醬鹵鴨翅中的菌落總數。

1.3.2 代謝組學檢測方法

1.3.2.1 樣品前處理

取100 mg液氮研磨的新鮮醬鹵鴨翅（樣本A）和13℃放置10 d的醬鹵鴨翅組織樣本（樣本B）于1.5 mL離心管中，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，然后置于離心機中，15 000 r/min，4℃離心10 min，取一定量的上清液加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中，15 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清液，過膜。從每個試驗樣本中各取20 μL，混勻，作為質量控制（quality control，QC）樣本，重復取樣3次，分別命名為QC1、QC2和QC3，用于平衡色譜-質譜系統和監測儀器狀態，對整個試驗過程中系統穩定性進行評價，進樣，進行LC-MS分析。

1.3.2.2 色譜條件

使用HyperilGoldcolumn（C18）色譜柱，柱溫40℃，流速0.2 mL/min。正模式：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為甲醇溶液。負模式：流動相A為5 mmol/L，流動相B為甲醇溶液。色譜梯度洗脫程序：0～1.5 min，98%A、2%B；1.5 min～14 min，0%A、100%B；14 min～17 min，98%A、2%B。

1.3.2.3 質譜條件

質譜掃描范圍選擇m/z 70～1 050；電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源的設置如下：噴霧電壓為3.2 kV，鞘氣45 arb，輔助氣10 arb，毛細管溫度320℃，化合物極性選擇正離子和負離子，MS/MS二級掃描為數據依賴掃描。

1.3.2.4 數據分析

將數據導入Compound Discoverer 3.1（CD）軟件中，進行保留時間和質荷比等參數的簡單篩選，對不同醬鹵鴨翅樣品進行峰對齊和峰提取，再與數據庫mz－Cloud、mzVault和MassList進行比對，得到代謝物的定量定性結果。并對代謝物進行多元統計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），揭示常規氣調貯藏10 d后的變質醬鹵鴨翅和新鮮醬鴨鹵翅的代謝物差異性。

2 結果分析

2.1 菌落總數分析

微生物是引起醬鹵鴨翅腐敗變質的主要原因之一，菌落總數的測定可以用來判定食品被微生物污染的程度以及衛生質量。圖1是醬鹵鴨翅儲藏過程中菌落總數變化情況。

圖1 儲藏時間對醬鹵鴨翅菌落總數的影響Fig.1 Effect of storage time on aerobic plate count in sauced duck wings

從圖1中可以看出，隨著儲藏時間的延長，醬鹵鴨翅中的菌落總數呈顯著上升趨勢。根據GB 2726—2016《食品安全國家標準熟肉制品》中規定醬鹵鴨翅中的菌落總數≤5 lg（cfu/g），在儲藏至第7天時，醬鹵鴨翅中的菌落總數達到5.03 lg（cfu/g），已超過腐敗變質臨界點。而儲藏至第10天時，菌落總數已升高至7.20 lg（cfu/g），為嚴重變質樣品，已失去食用價值。為更好研究新鮮醬鹵鴨翅與變質醬鴨翅之間代謝物的差異，本文選用第10天的變質樣品進行代謝物分析。

2.2 數據質控分析

基于峰面積值來計算QC樣本之間的pearson相關系數。圖2是正離子模式和負離子模式下QC樣本之間的pearson相關性分析結果。

圖2 正離子和負離子模式下QC樣本相關性分析Fig.2 Correlation analysis of QC samples in positive and negative ion modes

從圖2中可以看出，正、負離子模式下QC樣本的R2均大于0.993、0.991，接近于1，QC樣本相關性高，整個試驗過程穩定性好，數據質量高。

非靶向代謝組學的數據是多維和復雜的，而PCA分析是一種常用的無監督識別技術，能將醬鹵鴨翅代謝物按一定的權重通過線性組合進行降維，然后將降維后產生的新變量進行歸類，可以從總體上反映各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小[19]。圖 3 是正離子（pos）和負離子（neg）模式下總樣本的PCA得分情況。

圖3 正離子和負離子模式下總樣本的PCA得分圖Fig.3 PCA score of the total sample in positive and negative ion modes

從圖3中可以看出QC樣本緊密聚集在一起，QC樣本差異較小，說明整個試驗方法穩定性好、重復性高、數據可信度高，可進行后續的試驗分析。此外，從總樣本正、負離子模式的PCA得分圖中還可看出變質醬鴨翅樣本組與新鮮醬鴨翅樣本組是完全分離的，說明，兩組樣品的代謝物在種類和相對含量上均具有顯著差異。

2.3 PLS-DA分析

PCA分析是一種“無監督”的分析模式，在不給定醬鴨翅樣本分組信息的情況下，單純根據檢測出的數據特征進行分析，反映的是醬鴨翅代謝數據的原始狀態。而PLS-DA分析是在已知樣本分組信息情況下，進行“有監督”的數據分析模式，可以更好地獲取樣本組間差異。R2Y表示所建模型對兩組醬鴨翅樣本的判別解釋能力，Q2Y表示PLS-DA模型對未知樣本的預測能力，R2Y和Q2Y數值越接近1，表明模型越穩定可靠[20]。本試驗經7次循環交互驗證得到新鮮醬鴨翅和變質醬鴨翅的PLS-DA模型（圖4）。

圖4 正離子和負離子模式下PLS-DA模型得分圖Fig.4 Scores diagram of PLS-DA in positive and negative ion modes

如圖4所示，兩組醬鴨翅樣本之間被明顯區分且相距較遠，這可能是由于儲藏過程醬鹵鴨翅中的微生物大量繁殖導致代謝物的種類和含量變化顯著，進一步說明變質醬鴨翅組（樣本B）與新鮮醬鴨翅組（樣本A）的代謝物差異顯著，這與PCA分析結果相一致。正離子模式下R2Y=1.00，Q2Y=0.93，負離子模式下R2Y=1.00，Q2Y=0.91，表明模型穩定可靠。此外，R2Y均大于Q2Y且都大于0.5，表示新鮮醬鴨翅組和變質醬鴨翅組比較對的PLS-DA模型建立良好。

為進一步判別PLS-DA模型質量的好壞，本試驗采用排序驗證法進行200次數據的隨機打亂后得到圖5。

圖5 正離子和負離子模式下PLS-DA排序驗證圖Fig.5 PLS-DA sort verification in positive and negative ion modes

如圖5所示，R2數據均大于Q2數據，且正離子模式的Q2=-0.89和負離子模式的Q2=-0.76均小于0，表明模型未過擬合且穩定，具有很好的預測能力和樣本解釋能力，數據可進行下一步分析[10]。

2.4 差異代謝物的篩選與鑒別

采用PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）值，并結合T-test的P值來尋找醬鴨翅變質過程中的差異性表達代謝物，設置VIP＞1.0，差異倍數FC＞4或FC＜0.25且P＜0.05，篩選出的醬鹵鴨翅變質前后差異代謝物如表1所示。

表1 A、B組差異代謝物Table 1 Differential metabolites of group A and B

從表1可以看出，變質醬鹵鴨翅組（樣本B）與新鮮醬鹵鴨翅組（樣本A）比較對共鑒定出顯著差異代謝物35種，其中磷脂10種、氨基酸及其衍生物類5種、酚類1種、有機酸類3種、酯類3種、酮類7種、生物堿1種，其他5種。磷脂分為甘油磷脂（glycerophospholipids，GP）和鞘脂（sphingolipids，SP）兩大類[21]，GP 又分為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines，PC）及磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）兩個亞類，鞘磷脂（sphingomyelin，SM）是SP的一個亞類。大部分PC亞類脂質在13℃儲藏10 d后均有顯著上調，如PC（14∶0e/22∶2）、PC（18∶5e/22∶6）、PC（22∶5e/16∶3）。氧化磷脂酰膽堿（oxidized phosphatidylchlines，OXPC）（16∶0-18∶3+1O）和 OXPC[16∶0-18∶1+1O（1Cyc）]在儲藏 10 d后分別增加4.496 3倍和5.361 5倍。由于高含量的PC具有自氧化作用[22]，表明醬鹵鴨翅在儲藏10 d過程中發生了大量的氧化代謝。此外，溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-phosphatidylethanolamine，LPE）在儲藏過程中增加了9.404 8倍。根據葉可萍等[23]的研究，發現醬鹵鴨翅儲藏末期的優勢菌為嗜冷桿菌屬。嗜冷桿菌在低溫儲藏期間大量繁殖，產生胞外脂肪酶、磷脂酶等酶類，從而水解醬鹵鴨翅中的脂類，使得磷脂結構和比例變化，導致醬鹵鴨翅的變酸、變哈。

從表1中可以看出，差異代謝物中的氨基酸及其衍生物總體顯著上調，主要有L-色氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸、谷胱甘肽還原型、谷胱甘肽氧化型，下調的只有S-腺苷高半胱氨酸。這可能是由于在醬鹵鴨翅低溫儲藏過程中，腐敗優勢菌群嗜冷桿菌分泌了大量的胞外蛋白酶，使得蛋白質降解，氨基酸含量上調。而S-腺苷高半胱氨酸下調可能是由于在儲藏過程中優勢腐敗菌群內的S-腺苷高半胱氨酸水解酶活性增加，將其水解為腺苷和高半胱氨酸，其水解產物再參與微生物生長繁殖[24-25]。咖啡因是一種甲基黃嘌呤生物堿。表1中顯示醬鹵鴨翅儲藏前后咖啡因提高了61.593 4倍，可能是鴨翅微生物中的核糖核苷酸降解生成嘌呤核苷酸，提供嘌呤環，增加了咖啡因的含量[26]。

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

為了進一步探究醬鹵鴨翅變質前后差異代謝物的變化情況，本文將通過KEGG中的Pathway數據庫對變質前后的35種差異代謝物進行通路富集分析，共富集到17條代謝通路，具體見表2。

表2 差異代謝物的代謝途徑Table 2 Metabolic pathways of the differential metabolites

如表2所示，L-色氨酸參與的代謝通路有11條，由此可見L-色氨酸在醬鹵鴨翅儲藏變質過程中是處于多條通路的交集處，對醬鹵鴨翅代謝通路影響較大[27]。

3 結論

本研究采用LC-MS非靶向代謝組學結合PCA和PLS-DA分析法對醬鹵鴨翅變質前后的差異代謝進行分析物。共篩選出35種差異代謝物，主要包括磷脂、氨基酸及其衍生物類、有機酸類、酮類、生物堿等，其中上調的差異代謝物有20種，下調的差異代謝物有15種。磷脂差異代謝物總體上調，如亞類 PC（18∶5e/22∶6）、PC（22∶5e/16∶3）、PC（14∶0e/22∶2）、OXPC（16∶0-18∶3+1O）、OXPC[16∶0-18∶1+1O （1Cyc）]、SM （d15∶0/15∶1）、LPE（17∶1）、PEtOH（19∶1-20∶4）。氨基酸及其衍生物類差異代謝物也總體上調，如L-色氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸、谷胱甘肽還原型、谷胱甘肽氧化型。代謝物磷脂和氨基酸含量的顯著變化與優勢腐敗菌嗜冷桿菌的生命活動息息相關。