黑參皂苷的提取純化及其對MGC-803細胞凋亡的影響

郭曉萌，魏婷，張焱

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

人參，為五加科植物人參的干燥根，具有抗腫瘤[1]、降血糖[2]、提高免疫力[3]、抗炎[4]等多種活性，最具藥理活性的成分是人參皂苷[5]，其中人參皂苷Rg3、Rb1、Rh2等具有抗腫瘤活性。黑參是人參的新炮制品，在傳統方法中，黑參是通過九蒸九曬制成的。調查者明確指出，加工后的生曬參不僅色澤改變，而且有效成分及藥理作用也發生了變化，主要是在制備過程中形成了稀有皂苷，因此黑參有更強的生物活性[6]。除此之外，黑參還有抗氧化[7]、調節心血管功能[8]等作用。因此黑參的發展潛力很大。

胃癌是世界第四大癌癥。早期胃癌由于癥狀不明顯而被患者忽視，所以絕大多數患者到胃癌中晚期才被確診且五年生存率很低[9]。幽門螺桿菌感染、飲食、煙酒是胃癌發病的主導因素[10]。由于其他治療方法對人體的副作用大，所以急需研究對人體傷害低、副作用小的抗癌天然藥物。

細胞凋亡途徑有兩種：外源型和內源型途徑。前者是通過線粒體膜電位的降低，Cyt-C釋放到細胞質中，活化半胱氨酸蛋白酶Caspase-3，最終導致細胞凋亡[11]。后者是通過刺激關鍵跨膜死亡受體家族成員（如Fas蛋白），進一步激活起始蛋白Caspase-8和執行者蛋白Caspase-3，最終導致凋亡級聯反應[12]。研究表明一些化療藥物可以同時引起細胞外源性和內源性凋亡[13]。Wu等[14]研究發現人參皂苷Rh4能調節Cdk4和Cyclin D1的表達，使SW480細胞停滯在G0/G1期，并通過改變Caspase-3，8，9的表達促進細胞的凋亡。另外，對大鼠的主要器官進行HE染色，結果顯示，Rh4對大鼠的器官無明顯損害。

人參皂苷具有多種生物活性，且稀有皂苷在自然界的含量很少，只能通過不同的制備方法或者轉化方法獲得，具有極高的利用價值。因此，本研究以生曬參為原料制備黑參，提取黑參皂苷，并進行純化，研究其對MGC-803細胞凋亡的影響，旨在探究黑參皂苷的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生曬參：北京同仁堂國藥有限公司，參齡5年，大小一致；MGC-803、HepG2、J82、SPC-A1 細胞：北京協和細胞庫；DMEM培養基：美國英杰生命技術有限公司；凋亡試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、異硫氰酸熒光黃（Annexin-V-FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、Tris-HCl緩沖鹽溶液 （TBS）、吐溫 20（Tween20）、ECL Plus發光劑：北京索萊寶生物科技有限公司；血清：上海李記生物科技有限公司；Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9、BCl-2：武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

液相色譜-質譜聯用儀（LC-30-SCIEX5600+）：島津（上海）實驗器材有限公司；流式細胞儀（BD FACSCaliber）：美國 BD 公司；電泳儀（164-5050）：美國伯樂公司；酶標儀（Synergy HTX）：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑參的制備

黑參制備工藝流程：生曬參→100℃蒸制5 h→100℃～102℃蒸制4 h→103℃～105℃蒸制4 h→106℃～108℃蒸 3 h→50℃取出→（50±2）℃干燥至水分含量＜12%。

1.3.2 黑參皂苷的提取及純化

1.3.2.1 黑參皂苷的提取

采用乙醇超聲輔助法提取黑參皂苷[15]，工藝流程：將黑參用粉碎機打成粉末，過80目篩，加入70%乙醇溶液，固液比 1∶40（g/mL），超聲 80 min（功率 1 000 W）。離心留上清，旋轉蒸發至無醇味后將溶液凍干即為黑參皂苷。

1.3.2.2 D101大孔吸附樹脂純化黑參皂苷

D101大孔樹脂經預處理后使用。上樣：稱取黑參皂苷2 g，加一定的超純水溶解后，用過濾器過濾去除雜質以防堵住樹脂柱，然后以100 mL/h流速流穿樹脂柱，多次反復上樣，直至飽和吸附。洗脫：先用超純水洗脫色素雜質，然后分別用200 mL 20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次沖洗吸附在樹脂中的皂苷，收集至每個離心管里，旋轉蒸發后冷凍干燥各組皂苷。

1.3.3 人參皂苷含量的測定

采用香草醛-硫酸比色法測定皂苷含量：準確稱取一定量的人參皂苷Re標準品用甲醇溶液溶解，使濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。稱取一定量的樣品用甲醇溶解，使濃度為0.5 mg/mL。分別吸取標準品和樣品0.5 mL加入對應試管，然后在試管中分別加入0.5 mL 8%的香草醛和5 mL 77%的硫酸，60℃下水浴20 min。同時設置空白組（蒸餾水代替樣品）。酶標儀在540 nm處測得吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 液相色譜-質譜聯用檢測

1.3.4.1 液相色譜條件

色譜柱為 C18（150 mm×2.5 mm，5 μm），柱溫為35℃，流速為0.3 mL/min，流動相比例見表1。

表1 流動相比例Table 1 Mobile phases ratio

1.3.4.2 質譜條件

采用電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）負離子模式進行檢測。ESI源條件：霧化氣壓（Gas 1）為50 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣壓（Gas 2）為50 psi，氣簾氣（curtain gas，CUR）為 25 psi，離子源溫度 450℃，離子源電壓4400V，質譜掃描范圍為100Da～1 200 Da，質量掃描范圍為50Da～1000Da，質譜累計時間0.2 s，離子累計時間0.01 s，二級質譜采用信息依賴獲取方式（information dependent acquisition，IDA）獲得，并采用高分辨模式，去簇電壓（declustering potential，DP）±60 V，激發碰撞電壓（35±15）eV。

1.3.5 MTT法測細胞活性

將細胞置于10%胎牛血清的DMEM培養液中，37℃、5%CO2條件下標準培養。取細胞，接種于96孔板。用不同濃度（0～300 μg/mL）的皂苷培養液分別處理細胞 24、48、72 h，處理后分別加入 50 μL MTT 繼續培養4 h，輕輕吸去上清150 μL，每孔再加入150 μL DMSO溶液，搖床振蕩15 min，酶標儀490 nm處測得OD值。

1.3.6 Hoechst 33258染色檢測黑參皂苷對MGC-803細胞的細胞核形態變化

將狀態良好的細胞接種于6孔板，并用不同濃度（100、150、200 μg/mL）黑參皂苷和對照組（未加黑參皂苷）處理細胞24 h。將每孔漂浮細胞轉移至對應離心管，其余貼壁細胞加入0.5 mL胰酶消化，等待細胞變圓后加1 mL培養液終止消化，移入對應的離心管，在1 200 r/min速度下離心5 min。細胞沉淀用Hoechst 33258染液重新懸浮，37℃，避光30 min，倒置熒光顯微鏡進行拍攝[16]。

1.3.7 Annexin V-FITC/PI雙染測定黑參皂苷誘導MGC-803細胞凋亡

處理細胞及收集細胞步驟見1.3.6。向細胞沉淀加入緩沖液500 μL，Annexin V-FITC染色液和PI溶液各5 μL。混合避光15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.8 黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞線粒體膜電位的影響

處理細胞及收集細胞步驟見1.3.6。向細胞沉淀加入50 μL羅丹明123溶液，37℃30 min，生理鹽水洗3次后流式細胞儀檢測線粒體膜電位水平。

1.3.9 黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響

處理細胞及收集細胞步驟見1.3.6。向細胞沉淀加入2 mL 2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）20 min。每隔 5 min混勻1次，使其混合更加充分。最后用生理鹽水洗3次后流式細胞儀檢測細胞的ROS水平。

1.3.10 Western Blot檢測MGC-803細胞凋亡蛋白的表達

處理細胞及收集細胞步驟見1.3.6。收集細胞后加入細胞裂解液提取細胞蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸5 min使其變性，然后存放于-80℃冰箱。用12%的分離膠分離蛋白后轉印在PVDF膜上，并把膜放入含有5%封閉液的孵育盒中封閉2 h。然后分別加入一抗（Bax、Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9）4 ℃過夜，1×TBST（TBS+Tween20）沖洗 15 min，共兩次。二抗孵育（稀釋比例 1∶5 000）2 h，用 1×TBST 緩沖液洗滌膜3次，每次洗10 min，最后將膜置于ECL Plus發光劑中顯影定影。拍照后分析計算相對灰度值。

1.4 數據分析

結果以平均值±標準差的形式表示，用GraphPad Prism進行顯著性分析和誤差分析，若p＜0.05則代表具有顯著性，用Prism8.0.2作圖。

2 結果與分析

2.1 黑參皂苷純化前后的含量對比

人參皂苷Re標準曲線如圖1所示。

圖1 人參皂苷Re標準曲線Fig.1 Standard curve of ginsenoside Re

由圖1可知，純化前的皂苷含量為52.43%，推測是由于用70%乙醇提取皂苷，使提取物中含有色素、少部分多糖、脂溶性雜質等成分，影響了黑參皂苷的純度。為了提高皂苷的含量，在對比其他型號的樹脂后，選用D101大孔樹脂進行純化，不同濃度乙醇洗脫液中皂苷含量見圖2。

圖2 各洗脫液黑參皂苷含量Fig.2 Content of black ginseng saponins in each eluent

由圖 2可知，20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇洗脫液中黑參皂苷含量分別為13.66%、20.1%、54.76%、74.56%、93.55%、39.87%和30.98%。開始洗脫時（乙醇濃度20%～60%），因色素、多糖等雜質的存在，皂苷含量較少；隨著乙醇梯度洗脫（乙醇濃度70%～80%），雜質被洗脫，含量逐漸減少，皂苷含量隨之升高；當乙醇濃度達到90%～100%時，樹脂吸附的皂苷已洗脫完全，含量逐漸降低。最后將70%～80%這一階段的洗脫液混合、旋蒸、凍干，并檢測其皂苷含量為89.02%。相對于純化前皂苷含量52.43%，純化后的含量提升了36.59%。D101大孔樹脂具有無毒無害、高解吸率、快速等特點，對提取和純化黑參皂苷有良好的效果。

2.2 黑參和人參皂苷的化學成分

LC-MS能快速、精確地測定人參皂苷的主要成分。Sun等[17]檢測黑參中19種人參皂苷，其中Rg6、Rk3、Rg3、Rg5等為稀有人參皂苷，有較強的抗癌活性。通過LC-MS分析并鑒定黑參和人參皂苷的化學成分，總離子流圖如圖3所示。

圖3 黑參皂苷和人參皂苷總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of black ginseng saponins and ginsenosides

通過高分辨質譜保留時間和多級碎片離子的分析，初步推斷出黑參皂苷中含有14種人參皂苷類成分，分別為 Rg3、Rb3、Ro、Rb1、F3、Rb2、Re、F1、Rh1、Rf、Rg2、Rh2、Rg5、CK，而人參皂苷中含有 5 種，分別為 RO、Re、Rb2、F1、Rf，具體質譜數據見表 2 和表 3。

表2 黑參皂苷質譜數據Table 2 Mass spectrometry data of black ginseng saponins

表3 人參皂苷質譜數據Table 3 Mass spectrometry data of ginsenosides

由表2和表3可知，二者的不同之處在于黑參皂苷比人參皂苷多 9 種皂苷，如：Rg3、Rh1、Rh2、Rg5、CK等，其中Rg3和Rg5是稀有皂苷。推測是由于高溫條件下制備黑參時，可能發生了以下反應。

1）C-20位糖苷鍵發生水解反應

含糖基較多的原生皂苷變為次生皂苷，優先脫去原人參二醇或原三醇型皂苷C-20位的糖基，如：蒸制干燥過程中人參皂苷Re在C-20位脫去一分子葡萄糖，轉化為Rg2。人參皂苷Re在C-6位末端脫去一分子鼠李糖，轉化為Rg1，Rg1在C-20位脫去一分子葡萄糖化為Rh1。二醇組皂苷C-20位上的糖鏈全部脫掉，C-3位糖鏈末端被水解，一部分生成Rg3，Rg3進一步發生水解反應生成Rh2[18]。人參皂苷Rb1在C-20位末端脫去一分子葡萄糖，轉化為人參皂苷Rd，人參皂苷Rd在C-20位末端脫去一分子葡萄糖，轉化為Rg3[19]。

2）羥基脫水反應

苷元的C-12和C-20位羥基脫水生成雙鍵結構[20]。如：Rg3在C-20位羥基脫水縮合形成雙鍵生成Rg5。

3）丙二酸單酰基脫去反應

人參皂苷在高溫條件下會水解脫去丙二酸。生曬參中的丙二酸單酰基人參皂苷受熱發生水解反應，生成了相應的人參皂苷 Rc、Rd、Rb1、Rb2。

這些反應使得原級皂苷轉化為稀有皂苷。稀有皂苷在自然界中含量較少，具有獨特的使用價值，稀有皂苷可能使黑參有更強的生物活性。

2.3 黑參皂苷對細胞增殖的抑制情況

采用MTT法對黑參皂苷進行體外抗腫瘤活性實驗，測定其對 MGC-803、HepG2、J82、SPC-A1 細胞 24 h的抑制率，比較黑參皂苷對4種癌細胞的活性。結果如表4所示。

表4 黑參皂苷對4種癌細胞的IC50值Table 4 IC50 of black ginseng saponins against four kinds of cancer cells μg/mL

由表4可知，黑參皂苷對4種癌細胞的IC50值不同，其中，對胃癌MGC-803細胞的IC50最小，說明對此細胞的抑制作用最明顯。所以決定使用胃癌MGC-803細胞進行后續試驗，研究凋亡機制。人參皂苷（a）與黑參皂苷（b）對MGC-803細胞活性的影響見圖4。

圖4 人參皂苷與黑參皂苷對MGC-803細胞活性的影響Fig.4 Effect of ginsenosides and black ginseng saponins on viability of MGC-803 cells

由圖4可知，人參皂苷和黑參皂苷對MGC-803細胞均有抑制作用，細胞存活率隨劑量的提升呈下降趨勢，且各個濃度在給藥24、48、72 h后的細胞存活率均隨時間延長而逐漸下降。人參皂苷24 h的IC50為 296.64 μg/mL，48 h 的 IC50為 266.46 μg/mL，72 h的IC50為188.40 μg/mL；而黑參皂苷 24 h的IC50為141.25 μg/mL，48 h 的 IC50為 120.23 μg/mL，72 h 的 IC50為95.50 μg/mL。以上結果表明黑參皂苷對MGC-803細胞具有更強的抑制作用。抑制率均具有時間-劑量依賴性，并呈現出時間-劑量關系。

2.4 Hoechst 33258染色觀察黑參皂苷對MGC-803細胞核變化情況

Hoechst 33258是一種藍色熒光染液，它能穿過細胞膜，在凋亡細胞的細胞核呈致密濃染[21]。

由圖5可知，對照組細胞呈現淡藍色熒光，染色質在核仁內分布均勻。當用黑參皂苷處理胃癌MGC-803細胞時，由于染色質聚集和細胞核固縮，分裂成很多的核碎片，所以細胞發出亮藍色熒光[22]。并且隨著黑參皂苷濃度的增加，亮藍色熒光也隨之增強。經150 μg/mL和200 μg/mL黑參皂苷處理的細胞亮藍色熒光強度高于其余處理組。Hoechst 33258染色結果代表著黑參皂苷誘導胃癌MGC-803細胞核發生改變，呈現典型的細胞凋亡現象。

圖5 Hoechst 33258染色熒光顯微鏡拍照（400倍）Fig.5 Nuclei of MGC-803 under fluorescence microscope（400 ×）（Hoechst 33258 staining）

2.5 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡情況

黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞凋亡的影響見圖6。

圖6 黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of black ginseng saponins on apoptosis of gastric cancer MGC-803 cells

如圖6所示，隨著黑參皂苷濃度的增加，早期、晚期凋亡的細胞明顯增多，說明黑參皂苷對MGC-803細胞有凋亡影響。早期凋亡由0.02%增長到12.7%，晚期凋亡由0.21%增長到54.26%，總凋亡率由0.23%增長到66.96%（p＜0.001）。這一結果與唐立等[23]研究人參皂苷對SNU-1細胞有凋亡作用的結論一致。證明了在黑參皂苷作用下，MGC-803細胞發生凋亡的事實。

2.6 黑參皂苷通過降低線粒體膜電位促使細胞凋亡

線粒體膜電位的變化反映了線粒體的功能，與細胞凋亡有重要聯系，是細胞凋亡過程中最早的一種不可逆的變化，發生比DNA斷裂更早。這種改變可以導致細胞膜的滲透，并導致Cyt-C的釋放[24]。羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）的熒光強度代表著線粒體膜電位的改變，并與染色的熒光強度呈正相關[25]。黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞線粒體膜電位的影響見圖7。

圖7 黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞線粒體膜電位的影響Fig.7 Effect of black ginseng saponins on mitochondrial membrane potential of gastric cancer MGC-803 cells

Rh123的變化代表細胞凋亡的程度。趙嘉琪等[25]研究表明，人參皂苷CK能使肝癌細胞的線粒體膜電位降低。由圖7可知，與對照組相比，Rh123的強熒光細胞比例從97.04%下降到23.45%（p＜0.001），隨黑參皂苷劑量的增大而降低。說明細胞與Rh123的結合能力降低，即線粒體膜電位下降，是一種不可逆的變化，這表明細胞已經發生凋亡，細胞凋亡的比例也隨黑參皂苷濃度升高，進一步證實了黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞的影響是通過線粒體途徑促使細胞凋亡。

2.7 黑參皂苷通過ROS途徑誘導MGC-803細胞凋亡

ROS在腫瘤發展中具有重要的調節作用，ROS能增加線粒體膜的通透性使其氧化損傷，導致細胞凋亡[26]。因此，活性氧水平在細胞凋亡過程中也起著重要作用。

李曼玲等[27]研究表明，人參皂苷Rg3能通過ROS途徑誘導細胞凋亡。為了研究MGC-803細胞凋亡是否和ROS有關，進行了ROS實驗。活性氧熒光探針（DCFHDA）可被標記在細胞內，隨著濃度升高，凋亡細胞增加。黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞ROS水平的影響見圖8。

圖8 黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞ROS水平的影響Fig.8 Effect of black ginseng saponins on ROS level in gastric cancer MGC-803 cells

由圖8可知，隨著黑參皂苷劑量的增加，峰明顯向右平移，表明熒光探針的熒光強度逐步升高，黑參皂苷濃度為200 μg/mL時，ROS水平為74.65%，與對照組相比呈明顯上升趨勢（p＜0.001）。說明當細胞不能有效地除去產生的ROS，就會導致細胞膜脂質過氧化。細胞膜被破壞，線粒體膜通透性增加，導致了線粒體功能受損，從而引起凋亡。這與李曼玲等[27]研究結果一致，DCFH-DA染色實驗再次證明了黑參皂苷可以誘導胃癌MGC-803細胞中生成大量ROS并在細胞內累積，導致細胞損傷從而誘導細胞凋亡。

2.8 黑參皂苷通過改變相關凋亡蛋白表達促使MGC-803細胞凋亡

細胞凋亡是由多種蛋白緊密調控的。Bcl-2是一種可以調節細胞凋亡和保持線粒體膜完整的抗凋亡基因，可防止細胞凋亡[28-29]，Bax則可促進細胞凋亡[30]。因此，當細胞開始凋亡時，不同的細胞凋亡蛋白可以轉移到線粒體中，造成細胞膜通透性的下降。線粒體膜對H+的滲透作用增強，使線粒體膜電位下降[30]。進而使Cyt-C釋放，引發Caspase家族級聯反應，最終凋亡。Caspase家族分為3類：凋亡起始、凋亡效應[31]和炎癥Caspase[32]，其中凋亡起始和效應是通過起始Caspase激活下游效應Caspase引發凋亡。Caspase-3是凋亡執行中最關鍵的一環，其主要依靠Cyt-C的釋放。實驗測定了 Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9 蛋白的表達，結果見圖9。

圖9 黑參皂苷對MGC-803細胞相關凋亡蛋白表達的影響Fig.9 Effect of black ginseng saponins on the expression of apoptosis-related proteins in MGC-803 cells

如圖9所示，經Image J軟件分析得知：與β-actin相比，Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9 表達量增加，Bcl-2的表達量減少。說明在一定濃度下，黑參皂苷能顯著提高Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白的表達量，并降低Bcl-2的表達量。

已有文獻證明人參皂苷可通過線粒體途徑使癌細胞發生凋亡，如熊明華[33]證實了人參皂苷Rg3能降低Bcl-2的表達量，促進Bax的表達，從而誘導Hela細胞發生凋亡。Wang等[34]結果表明：人參皂苷CK對膀胱腫瘤T24細胞有顯著的抑制作用，經CK處理后的細胞Bcl-2表達量降低，而Bax、Procaspase-3和Procaspase-9表達量提高。Gu等[35]研究發現人參皂苷Rd能促進人膠質瘤U251細胞凋亡，其機制是通過下調Bcl-2的表達量以及上調Caspase-3的表達量使細胞凋亡。

因此推斷黑參皂苷作用于胃癌MGC-803細胞時，Bax轉移至線粒體中，造成線粒體膜的通透性下降，從而使H+的滲透作用增強，線粒體膜電位下降、Cyt-C釋放，進而引發Caspase-3和Caspase-9級聯反應，通過內源性細胞凋亡途徑誘導胃癌MGC-803發生凋亡。

3 結論

將生曬參在高溫高濕條件下制成黑參，采用乙醇超聲輔助法提取、D101大孔樹脂純化皂苷，利用LCMS對人參和黑參中的皂苷類成分進行了比較，發現黑參中含有14種單體皂苷，而人參中含有5種。人參不含 Rg3、Rh1、Rh2、Rg5、CK 等單體皂苷。可能是由于在制備黑參的過程中普通皂苷在高溫高濕的條件下發生糖苷鍵水解、羥基脫水等反應轉化為稀有皂苷。黑參皂苷對胃癌MGC-803細胞的抑制作用比人參皂苷更強，其凋亡機制是通過Bax、Bcl-2蛋白表達的改變進而導致線粒體膜電位變低，釋放Cyt-C，活化半胱氨酸蛋白酶家族成員細胞Caspase-9及凋亡執行蛋白酶Caspase-3，從而誘導細胞凋亡。有助于黑參的進一步開發與利用，為人參產業發展作出貢獻。