清解化攻湯對急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障和血清炎癥因子的影響

劉錕榮,盧 潔,秦百君,安曉霞,,李 慧,唐曦平,陳國忠

(1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；3.廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室，廣西 南寧 530023；4.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 530021)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一種較為多見的消化系統危重疾病，相關數據顯示其發病率逐年升高[1]。約20%的AP患者為中度重癥及重癥，常并發有器官衰竭或胰腺和胰周組織壞死，病死率高，已成為嚴重危及國民生命和健康的重大疾病之一[2]。最近的研究發現，腸黏膜屏障功能和完整性在AP的發病和進展過程中有著重要的作用，腸黏膜屏障損傷后導致腸黏膜通透性增加可進一步引發腸道細菌的移位，并進一步誘發胰腺感染壞死以及多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，迫使AP向重癥進展，而在AP中過度釋放的炎癥因子又是引起腸黏膜屏障損傷的重要因素[3-4]。因此，控制炎癥因子的過度釋放以及保護腸黏膜屏障在AP的治療中顯得尤為重要。

越來越多的研究發現中醫藥在AP的治療中可發揮良好的作用，且國內指南也把中藥對AP的治療方法作為強推薦[1]，中醫藥在AP中的療效作用越來越受到重視。對于AP發病初期，廣西名中醫陳國忠教授結合廣西所處嶺南地帶的氣候特點，對臨床AP患者的發病規律進行了總結，認為該病發病以“濕”“熱”“毒”“瘀”為主要病機，邪氣阻滯導致腑氣不通，因此陳教授在此基礎上創立的經驗方清解化攻湯，在臨床上對治療AP有明確的療效[5-7]，然而其干預作用仍需進一步實驗研究予以驗證。本研究擬在AP動物模型上就清解化攻湯對模型動物腸黏膜屏障及血清炎癥因子的干預作用予以進一步驗證，擬為中醫藥治療AP提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只清潔級雄性SD大鼠，鼠齡8周，體重為(200±20)g，購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司[許可證號SCXK(湘)2019-0014]，在廣西中醫藥大學第一附屬醫院醫學分子生物學實驗室飼養[許可證號SYXK(桂)2019-0001]，飼養溫度為(22±2)℃，光照與黑暗每12 h交替進行，動物自由飲水和攝食并分籠喂養，經過1周適應喂養后開始實驗。

1.2 藥品及主要試劑 清解化攻湯(由柴胡、黃芩、大黃、枳實、厚樸等藥物組成，專利號：ZL201811021893.2，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室制作)，用藥前先將藥液濃縮成3.6 g/ml。注射用烏司他丁(國藥準字H19990134)，雨蛙素(17650-98-5，上海源葉生物科技有限公司)，脂多糖(L2880，美國Sigma)，血清淀粉酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-10(IL-10) 及D-乳酸、內毒素酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒為貝茵萊生物科技公司生產。Occludin抗體為博奧森生物生物技術有限公司生產。

1.3 動物造模、分組及干預 采用腹腔注射雨蛙素及脂多糖進行大鼠AP 造模，雨蛙素每次按50 μg/kg劑量注射， 1次/h，連續腹腔注射6次，最后1次注射后按10 mg/kg的劑量立即腹腔注射脂多糖。24只SD大鼠隨機分成假造模組、模型組、西藥組和中藥組，每組各6只。模型組、西藥組及中藥組按上述方法造AP模型，而假造模組則每次同時予腹腔注射與雨蛙素等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/h，連續6次，最后1次注射后亦立即腹腔注射與脂多糖等量的0.9%氯化鈉溶液。干預上，中藥組予清解化攻湯灌胃，每次給藥劑量為9 g/kg，分別于造模完成后立即給藥以及每隔6 h給藥1次，共給藥3次；西藥組予烏司他丁尾靜脈注射，每次給藥劑量為7.5×103U/kg，分別于造模完成后立即給藥以及每隔6 h給藥1次，共給藥3次；模型組及假造模組用等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃時間和頻次同中藥組。

1.4 標本采集 造模完成后13 h(即最后1次給藥1 h后)，以3 ml/kg劑量腹腔注射10%的水合氯醛，待成功麻醉后，開腹并經腹主動脈采血，靜置2 h后以4 ℃的溫度按3000 r/min的速度離心10 min后取上清，放在-80 ℃超低溫冰箱凍存備用。取回腸靠近回盲部末段10 cm處的回腸組織，一部分回腸組織立即予4%多聚甲醛固定，余回腸組織經0.9%氯化鈉溶液沖洗后迅速放于無菌凍存管中，凍存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.5 回腸組織病理學觀察 固定胰腺和回腸組織后，予石蠟包埋，經過切片和蘇木素伊紅(HE)染色后，通過電子光鏡查看組織切片的病理改變。

1.6 血清淀粉酶水平檢測及ELISA法檢測血清相關指標 血清淀粉酶的檢測嚴格按照淀粉酶檢測試劑盒所述操作要求逐步進行檢測。另外，血清TNF-α、IL-1β、IL-10、D-乳酸及內毒素水平的檢測嚴格按照所對應的ELISA試劑盒中說明書所述的操作方法和步驟進行檢測。

1.7 回腸Occludin蛋白表達量檢測 采用Western blot法對回腸組織中Occludin蛋白表達水平進行檢測，從-80 ℃超低溫冰箱將回腸組織取出，剪碎、勻漿并離心后取上清液得到總蛋白，采用SDS-PAGE電泳使不同的蛋白分離，轉膜后封閉，孵育Occludin抗體予4 ℃過夜，漂洗3次后予二抗室溫孵育1 h，漂洗3次后加入ECL試劑發光，在成像儀中曝光并拍照，Image J軟件分析記錄灰度值并予以進一步分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，當數據呈正態分布并且方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；當數據呈非正態分布或方差不齊時，采用非參數秩和檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠的一般狀態觀察 造模完成后13 h，假造模組大鼠無明顯異常表現，與假造模組比較，模型組大鼠精神狀態明顯變差，部分大鼠出現緊張、煩躁和易激惹，呼吸偏快、弓背屈腹；西藥組和中藥組大鼠精神狀態稍差，部分略見緊張，偶見煩躁和易激惹，部分呼吸稍增快，偶見弓背屈腹。

2.2 大鼠回腸黏膜病理改變 見圖1。鏡下觀察可發現，假造模組回腸黏膜絨毛完整，上皮下間隙未見明顯增寬，輕度與固有層分離，炎性細胞浸潤不明顯，偶可見固有層輕度充血。模型組回腸黏膜絨毛略不規整或破損，腸上皮下間隙稍見增寬，與固有層分離增大，局部炎性細胞浸潤增多，內皮下及固有層充血及出血明顯增多。西藥組和中藥組黏膜破損程度相對模型組輕，腸上皮下間隙增寬不明顯，與固有層稍有分離，較模型組減輕，局部炎性細胞浸潤比模型組減輕，兩組可見內皮下及固有層散在充血與模型組相似，但未見明顯出血，西藥組和中藥組比模型組病理改變明顯減輕。

A:假造模組；B:模型組；C:西藥組；D:中藥組

2.3 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較 見表1。與假造模組比較，模型組大鼠血淀粉酶水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均下降明顯(P<0.01)；與西藥組比較，中藥組略有下降，差異無統計學意義(P>0.05)。與假造模組比較，模型組血清TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；且對比西藥組，中藥組降幅更大(P<0.05)。與假造模組比較，模型組大鼠的血清IL-1β水平明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；與西藥組比較，中藥組略有下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。與假造模組比較，模型組血清IL-10水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均有所升高(P<0.01)；與西藥組比較，中藥組增高更明顯，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β及IL-10水平比較

2.4 各組大鼠血清D-乳酸及內毒素水平比較 見表2。與假造模組比較，模型組大鼠血清D-乳酸水平顯著提升(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；中藥組較西藥組降幅更明顯(P<0.05)。與假造模組比較，模型組大鼠血清內毒素水平顯著提升(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；中藥組較西藥組降幅更大,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清D-乳酸及內毒素水平比較(ng/ml)

2.5 各組大鼠回腸Occludin蛋白相對表達量比較 見表3(圖2)。與假造模組比較，模型組大鼠回腸黏膜組織Occludin的相對表達量明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯增高(P<0.01)；中藥組較西藥組增幅更大，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠回腸Occludin蛋白相對表達量比較

圖2 各組大鼠回腸Occludin蛋白條帶圖

3 討 論

至今為止AP的病死率仍偏高，且國內發病率逐年增加，然而其發病機制目前仍未完全清楚。經研究發現，AP的死亡與持續的全身炎癥反應綜合征(SIRS)密切相關，而MODS、胰腺或胰周繼發性感染是引起該病死亡的關鍵因素[8-9]。腸黏膜屏障損傷是AP的主要并發癥之一，是導致腸道細菌移位并進一步誘發胰腺組織感染、壞死和MODS以及因此使AP向重癥發展甚至導致死亡的重要因素[10]。而腸黏膜屏障損傷與炎癥因子的大量釋放關系密切[3-4]，且后者可引發“瀑布樣級聯反應”亦是引起SIRS和MODS發生以及使AP病情進展的重要原因[11-12]。由此可知，對腸黏膜屏障的保護以及對炎癥因子過度釋放的調控，在預防AP往重癥發展并降低其病死率中起著非常重要的作用。烏司他丁屬于胰蛋白酶抑制劑，為治療AP的常用藥物，臨床應用可改善患者的臨床結局[13-15]，可抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子釋放，減輕炎癥反應并可改善患者腸黏膜屏障功能，減少腸內細菌和內毒素移位的發生[16-17]。

AP主要歸屬于中醫的“腹痛”“脾心痛”“胃心痛”“胰癉”范疇，廣西名中醫陳國忠教授結合AP的發病規律以及廣西所處嶺南地帶多濕多熱的氣候環境特點，將AP發病主要歸結于“濕”“熱”“毒”“瘀”四大關鍵病機，由于濕熱毒瘀郁滯中焦，導致氣機阻滯、腑氣不通，而且氣機阻滯、腑氣不通為貫穿AP早期的基本病機。因此陳教授認為，對AP發病早期予清解化攻湯治療，以清熱解毒化濕、活血化瘀攻下為主要功效，準確靶向上述關鍵病機和腑氣不通的基本病機。該方組方包括柴胡、黃芩、大黃、枳實、厚樸等藥物，在臨床治療上可有效緩解AP癥狀、保護腸黏膜屏障以及降低血清TNF-α等炎癥因子水平[5-7]。因此，本研究擬通過在AP大鼠上的實驗研究對該方的干預作用加以驗證。

在健康人的腸道中，在腸黏膜屏障和各種結構的作用下，腸腔內的細菌及其產物難以進入血液循環[18]，腸黏膜屏障是抵御腸道內細菌入侵的重要屏障。AP發生發展中多種因素作用導致腸黏膜屏障損傷，此時Occludin等腸黏膜上的緊密連接蛋白表達減少，腸道通透性增加，大量細菌及內毒素、D-乳酸等毒素產物可通過腸屏障進入血液循環[19-21]，進而加重SIRS、引發感染及促使MODS的發生[22]，是促使AP往重癥發展的重要環節[23]。而維持人體正常的腸道黏膜結構及功能的完整性，可有效避免腸道細菌移位，從而減少繼發感染的發生[24]。本研究結果表明，清解化攻湯可減輕AP大鼠回腸黏膜的病理損傷，降低大鼠血清內毒素及D-乳酸水平，并可增加其回腸黏膜上緊密連接蛋白Occludin的表達，提示清解化攻湯對AP大鼠腸黏膜屏障損傷有較好的保護作用。

在炎癥因子方面，AP發病早期的無菌性化學性炎癥可激活多種炎癥通路，進一步促進炎癥因子、趨化因子、血小板激活因子和黏附分子的表達，TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子的大量釋放，可進一步促使中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞激活并向胰腺及局部浸潤，加劇了腺體損傷和局部炎癥反應。TNF-α及IL-1β作為促炎細胞因子，是AP發展中最密切相關的炎性細胞因子，可啟動對胰腺腺泡細胞損傷的炎癥反應，也是介導更多炎性細胞因子從胰腺組織或其他組織釋放的初始因子，可進一步誘導IL-6等炎癥因子的產生和釋放，使局部炎癥向全身炎癥反應發展。因此，TNF-α及IL-1β等炎癥因子與重癥AP及其并發的SIRS和MODS關系密切[25]。而抗炎細胞因子IL-10是一種負反饋調節細胞因子，可由巨噬細胞和樹突狀細胞分泌并反過來抑制這些細胞的活化，該細胞因子水平的上調，抑制TNF-α、IL-6、IL-1和IL-12等巨噬細胞分泌的炎癥因子的表達，還可通過抑制巨噬細胞和樹突狀細胞上共刺激物和主要組織相容性復合體Ⅱ的表達來抑制T細胞活化[26-27]。在AP發病早期，快速產生大量的炎癥因子，其中以TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子的大量釋放為主，引起與IL-10等抑炎細胞因子的不平衡，最終導致炎癥因子的瀑布級聯樣釋放、炎癥反應的進一步加重以及由局部擴大向全身，誘發及加重SIRS甚至MODS的發生。因此，減輕炎癥反應的關鍵還在于對炎癥因子的調控。本研究發現清解化攻湯可降低AP大鼠血清促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的水平，提高血清抑炎細胞因子IL-10的水平，提示清解化攻湯對AP大鼠血清炎癥因子有明顯的調控作用。

綜上所述，本研究表明清解化攻湯對AP大鼠的腸黏膜屏障有一定的保護作用，而且該方可降低血清促炎細胞因子水平，提高抑炎細胞因子水平，對AP大鼠血清炎癥因子有明顯的調控作用，可為后續進一步對中醫藥治療AP的研究提供依據。