清肝涼血解毒湯通過調控JAK2/STAT3信號通路減輕肝細胞損傷研究

張 浩，胡佩佩，王智蘭

(南京中醫藥大學南通附屬醫院，江蘇 南通 226000)

肝臟是重要的免疫器官，能夠儲存能量，解除毒素，是膿毒癥易受損的器官之一[1]。膿毒癥肝損傷(Sepsis-associated liver injury,SALI)多由缺血缺氧性損傷，膽汁淤積及過度炎癥引發[2]。中醫藥對于膿毒癥肝損傷的治療有一定療效，可以改善肝功能，降低炎癥因子水平[3]。炎癥因子分泌及炎癥通路的激活直接參與了肝損傷的發生和進展，減輕炎癥反應有助于改善肝細胞功能[4]。臨床辨證使用江蘇省名老中醫周光主任經驗方清肝涼血解毒湯治療膿毒癥肝損傷患者，有一定的療效。本研究制備清肝涼血解毒湯含藥血清，通過脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的L-02肝細胞損傷模型，探討清肝涼血解毒湯含藥血清對炎癥損傷的改善作用及對JAK2/STAT3信號通路的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞：SD級雄性大鼠8只，購自江蘇藥康生物有限公司，實驗動物生產許可證號:SYXK(蘇)2022-0004，飼養于南通大學動物實驗中心，進食配制基礎飼料。實驗用L-02肝細胞由南通市肝病研究所提供。

1.1.2 藥物及試劑：清肝涼血解毒湯藥物購自三越中藥有限公司，具體藥物組成：生地黃、茵陳各30 g，牡丹皮、生黃芩、玄參各20 g，赤芍、柴胡各12 g，金銀花15 g，連翹、梔子各10 g，黃連3 g。由南通市中醫院制劑室煎制。CCK-8試劑盒(日本同仁，批號：SJ626)；凋亡試劑盒(BD公司，批號：9283373)，LPS(Sigma公司，批號：L2630)，RNAiso Plus(Takara公司，批號：9105)，Prime Script RT Master Mix反轉錄試劑盒(Takara公司，批號：9108)，SYBR Green Master Mix試劑盒(南京諾唯贊公司，批號：R233-01)，BCA蛋白測定試劑盒(碧云天公司，批號：P00006)，p-JAK2(批號：ab32101)、p-STAT3(批號：ab76315)、β-actin抗體(批號：ab8226)，二抗(批號：ab6728)，均購自Abcam公司。IL-6(批號：111504873)、TNF-α(批號：111412179)引物購自上海生工。IL-6-F：5’-AATGAGGAGACTTGCCTGGT-3’，IL-6-R：5’-GCAGGACTGGATCAGGACT-3’；TNF-α-F：5’-CCCGAGTGACAAGAATGTAG-3’，TNF-α-R：5’-TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3’；GAPDH-F：5’-CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3’，GAPDH-R：5’-ATGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3’。

1.1.3 實驗儀器：實時熒光定量PCR儀器(美國Bio-rad公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，RT-1510酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 清肝涼血解毒湯含藥血清制備：清肝涼血解毒湯方藥煎煮，水煎濃縮藥液含生藥量0.4 g/ml。8只SD級雄性大鼠隨機分為空白組和給藥組，適應性飼養7 d后，開始灌胃，制備含藥血清。據人鼠體表面積換算，給藥組給藥劑量為1 ml/100 g，每天灌胃2次，空白組給予相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，連續5 d。最后一次灌胃2 h后，以3%戊巴比妥麻醉大鼠，心臟取血，分離血清，-20 ℃保存備用。

1.2.2 細胞分組及培養：L-02肝細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養。對數期細胞貼壁培養24 h后，分為五組：空白組(加入含10%空白組大鼠血清的培養基)，模型組(在空白組基礎上同時加入LPS)，清肝涼血解毒湯低、中、高劑量組則加入LPS和清肝涼血解毒湯含藥血清(1.25%、2.50%、5.00%)。

1.2.3 清肝涼血解毒湯對細胞增殖活力的影響：對數期生長的細胞種植于96孔板，每孔種植約8000細胞，細胞貼壁24 h后，棄去原培養基，更換含有1.25%、2.50%、5.00%、10.00%清肝涼血解毒湯含藥血清的培養基，同時設置空白對照孔，設置復孔，置于培養箱中培養，根據細胞活力選擇最佳的實驗清肝涼血解毒湯含藥血清濃度。

1.2.4 LPS誘導L-02肝細胞損傷模型：對數期生長的細胞種植于96孔板，每孔種植約8000細胞，細胞貼壁24 h后，棄去原培養基，模型組更換含有10、20、40、80 μg/ml LPS的培養基，同時設置空白對照組，設置復孔，置于培養箱中培養，根據細胞活力選擇最佳實驗LPS濃度。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖：將細胞按8000個/孔種植于96孔細胞培養板中，貼壁后更換不同濃度含藥血清培養(或不同濃度LPS培養基)，按照試劑盒說明書檢測各組細胞0、24、48、72 h的OD 450值。

1.2.6 流式實驗檢測細胞凋亡：L-02細胞貼壁后，加入不同濃度(1.25%、2.50%、5.00%)含藥血清，培養48 h，收集死細胞及貼壁細胞，根據說明書依次在細胞中加入PE Annexin V 和7-AAD 試劑，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 RT-PCR實驗檢測炎癥因子：收集細胞，用RNAiso試劑按照說明提取細胞總RNA，通過逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，進行PCR定量檢測白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達。GAPDH為內參，Power=2-△△Ct值計算相對表達量，采用Power 值行統計學分析。

1.2.8 Western blot實驗檢測p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平：提取各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度，140 V電泳，轉移蛋白至NC膜，牛奶封閉2 h，4 ℃一抗過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，室溫洗膜3次，β-actin做內參，顯影儀進行顯影。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計數資料用百分比表示，采用卡方檢驗；正態分布計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 LPS對細胞增殖活力的影響 見表1。不同濃度LPS刺激L-02細胞12、24、48 h后，細胞活力隨著LPS作用時間的延長、濃度的增加而逐漸下降。當LPS濃度為20 μg/ml，時間為24 h時，細胞存活率下降明顯(P<0.05)。最終選擇20 μg/ml LPS濃度24 h進行細胞實驗。

表1 不同濃度LPS干預L-02細胞活力的影響(%)

2.2 不同濃度清肝涼血解毒湯含藥血清對細胞增殖活力的影響 見表2。與空白對照組比較，1.25%、2.50%、5.00%含藥血清組細胞在培養24 h后，存活率無明顯改變，10.00%含藥血清組細胞存活率下降(P<0.05)。因此后續選擇1.25%、2.50%、5.00%含藥血清進行后續實驗，依次設為清肝涼血解毒湯低、中、高劑量組。

表2 不同濃度含藥血清對L-02細胞活力的影響(%)

2.3 不同濃度清肝涼血解毒湯含藥血清對細胞凋亡的影響 見表3(圖1)。與空白組比較，加入LPS后的模型組L-02細胞凋亡明顯增加；而清肝涼血解毒湯低劑量組細胞凋亡無顯著下降，清肝涼血解毒湯中劑量、高劑量組細胞凋亡率較模型組顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組細胞凋亡率比較(%)

A：空白組；B：模型組；C：清肝涼血解毒湯低劑量組；D：清肝涼血解毒湯中劑量組；E：清肝涼血解毒湯高劑量組

2.4 各組IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較 見表4。24 h后，與空白組相比，模型組IL-6、TNF-α表達量明顯升高。與模型組相比，清肝涼血解毒湯中劑量及高劑量組IL-6、TNF-α表達量下降(P<0.05)，而清肝涼血解毒湯低劑量組表達量下降不明顯，這表明中劑量、高劑量清肝涼血解毒湯含藥血清可有效降低IL-6、TNF-α mRNA水平。

表4 各組IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較

2.5 各組 p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平比較 見表5(圖2)。結果表明，模型組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達量均顯著升高，經過清肝涼血解毒湯含藥血清作用后，p-JAK2和p-STAT3表達下降，中劑量、高劑量清肝涼血解毒湯可明顯抑制p-JAK2表達，低、中、高劑量清肝涼血解毒湯均可抑制p-STAT3表達，蛋白表達與含藥血清濃度成正比(P<0.05)。

表5 各組 p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平比較

A：空白組；B：模型組；C：清肝涼血解毒湯低劑量組；D：清肝涼血解毒湯中劑量組；E：清肝涼血解毒湯高劑量組

3 討 論

炎性細胞過度激活并釋放大量炎性因子是膿毒癥發生發展的重要機制之一，而釋放的炎癥因子廣泛地參與了膿毒癥肝損傷[5]。清肝涼血解毒湯為臨床經驗方，是否有肝細胞的保護作用，臨床研究較少。本研究初步探討了清肝涼血解毒湯含藥血清通過JAK2/STAT3通路，減少炎性因子的釋放，減少肝細胞凋亡，從而緩解膿毒癥肝損傷的程度，旨在完善清肝涼血解毒湯在臟器保護中的作用，以期為臨床治療膿毒癥肝損傷提供新的思路。

肝細胞內含有TNF-α受體，對TNF-α敏感，因為TNF-α是較早合成的炎性因子，直接導致肝細胞的損傷，同時促進了其他炎癥因子的分泌釋放[6]。研究發現，白細胞介素和TNF-α在導致肝臟細胞損傷和炎癥的發生發展中具有協同作用[7]，形成級聯效應，導致過度炎癥。炎癥因子IL-6和TNF-α可以有效激活STAT3信號通路，來調節炎癥因子的分泌[8]。STAT3蛋白作為主要的炎癥介質之一，其活化和多種疾病密切關聯，如腫瘤[9]、衰老性疾病[10]、膿毒癥[11]等。肝細胞凋亡是造成肝臟損傷的重要環節，在膿毒癥肝損傷的發生發展中具有重要作用。中藥單體槲皮素被發現可以抑制高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達，抑制其核外易位，從而減少肝細胞氧化應激和細胞凋亡的發生，從而減輕急性肝損傷大鼠的肝損傷[12]。

清肝涼血解毒湯可由犀角地黃湯、黃連解毒湯加減而成，是周老師的臨床經驗用方。研究顯示，犀角地黃湯[13]，黃連解毒湯[14]對肝損傷均有較好的治療作用，兩方均能降低IL-6、TNF-α等因子的水平，改善患者的癥狀[15]，這與本研究結果一致，提示清熱解毒類中藥方劑的配伍使用，可以降低炎癥反應。降低炎癥因子分泌的有效成分可能涉及方內的多種中藥以及多種單體成分，其有效成分均發現有減輕炎癥反應以及治療肝損傷的作用。陳琪等[16]研究發現，地黃的水提物可以減輕雷公藤甲素所致小鼠肝臟氧化應激損傷，可以增強肝細胞啟動NF-E2相關因子2(Nrf2)表達，增加下游還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NQO1)的表達。于德清[17]研究發現，牡丹皮提純得到的有效成分丹皮酚、槲皮素、β-谷甾醇和沒食子酸，可以通過激活Nrf2/Keap1通路抑制氧化應激。四種有效成分都具有抗氧化和保肝作用，丹皮酚體內單獨給藥的效果更強。茵陳的水提物，對肝損傷小鼠也有保護作用，可以降低小鼠血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)，肝組織中丙二醛(MDA)、活性氧自由基(ROS)的含量及轉錄激活因子4(ATF4)、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)的蛋白表達，提升肝組織中錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性，從而改善氧化應激損傷[18]。清肝涼血解毒湯含有多種有效單體，正是復雜的單體抗炎作用，才使本方有較好的抗炎效果。而肝損傷及炎癥通路有很多[19]，JAK2/STAT3是經典的炎癥通路[20]，研究顯示中藥多種有效成分均可以通過JAK2/STAT3通路來改善肝損傷。胡黃連苷Ⅱ可以降低急性胰腺炎誘導的肝損傷大鼠肝組織的氧化應激因子和炎癥因子分泌，影響JAK2/STAT3信號通路的磷酸化[21]。而單體黃芩苷可以通過調節JAK2/STAT3信號通路來改善三氧化二坤誘導的肝損傷[22]。基于上述通路研究結果，本課題組也進行了通路研究，且實驗結果與之相符，發現復方用藥可以抑制JAK2/STAT3的激活。

本研究發現，清肝涼血解毒湯含藥血清可以降低LPS引起的肝細胞凋亡，減少IL-6、TNF-α的分泌，抑制p-JAK2和p-STAT3表達，且藥效以中、高劑量含藥血清作用更好。