基于轉化生長因子-β1信號通路探討紫草生肌膏對肛瘺大鼠的干預作用

郭 偉，閆麗霞，常少青，劉振麗

(1.保定市第二醫院肛腸科,河北 保定 071051;2.河北省第七醫院影像科,河北 定州 073000)

肛瘺是發生在肛門直腸周圍的膿腫潰破，患者初期出現肛瘺容易導致疼痛紅腫等不良癥狀，可以用保守方法治療，如服用抗炎類藥物，控制住肛腸部位的炎癥，也可以使用外用藥膏進行治療[1-3]。本病大多數是由肛管或直腸周圍的膿腫引起的，反復發作、自愈困難是其特點。紫草膏具有化腐生肌、解毒止痛之功效，主治熱毒蘊結所致的潰瘍[4]。紫草膏臨床療效肯定,安全性好，涂擦治療深Ⅱ度燒傷也有較好療效,能提高創面愈合率。轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)家族在炎癥、組織修復和胚胎發育發揮重要作用，紫草生肌膏是否通過對組織損傷有促進作用的TGF-β發揮作用，以及在肛瘺創傷后的修復作用研究較少[5-6]。

本研究擬通過大鼠肛瘺模型探究紫草生肌膏在大鼠肛瘺治療中的作用，并探究對炎癥因子、創面再生的影響，并從TGF-β1信號通路分析其作用機制，為紫草生肌膏在肛瘺的臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物： 60只8～10周齡雄性SPF級SD大鼠，體重(220±20)g，由北京邁德康納生物技術有限公司提供，許可證號:SYXK(京)2020-0050。

1.1.2 藥品與試劑：蘇木精-伊紅購于北京維德維康生物技術有限公司(180823)；IL-6 ELISA kit(H007)、IL-8 ELISA kit(H008)、IL-1β(H002)ELISA kit 檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；TNF-α ELISA kit(RAB0479)購于美國Sigma公司；VEGF ELISA試劑盒Kl-E684R購于美國Cygnus公司；PDGF ELISA(RAB1927)，Ang Ⅱ EIA 試劑盒(RAB0010)購于美國sigma公司；IGF-1R ELISA試劑盒購于南京博研生物科技有限公司。TGF-β1 antibody (ab179695，稀釋比1∶1000)，Samd3 antibody (ab122028，0.04～0.4 μg/ml)，p-Smad3 antibody (ab80588,稀釋比1∶10000)，CD31 antibody (ab182981，稀釋比1∶2000)，GAPDH antibody(ab9485，稀釋比1∶2500)及Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6721，稀釋比1∶5000)二抗抗體購于美國Abcam公司。

1.1.3 儀器設備：激光多普勒血流儀Peri Flux 5000 (SKK-1100)購于瑞沃德生命科技有限公司;RM2015 切片機，德國 Leica 公司；-80 ℃超低溫保存箱，美國Thermo公司；4 ℃冰箱，購自合肥美菱股份有限公司；高速低溫離心機(ESD-1733)，德國 Eppenndorf Centrifuge公司；TEF-1510多功能酶標儀，瑞士TECAN公司；DM-BA400-B顯微鏡，美國Motic公司；Western blot電泳儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠分組及飼養條件：SPF級鼠房進行SD大鼠飼養，溫度(25±5)℃,濕度為40%～55%，12 h交替照明，自由攝食和飲水。

1.2.2 大鼠肛瘺動物模型的建立、分組及處理:大鼠分為對照組、模型組和試驗組。大鼠采用戊巴比妥鈉進行麻醉后，手術區剃除肛門部毛發備皮并進行消毒，在肛管旁用標記筆作半徑1.25 cm的圓形標記，并切開肛管，傷口深達肌肉層約0.3 cm，止血后在創面滴1.5 ml糞液，并用油紗、敷料和膠帶固定48 h，造模成功標準為傷口有糞臭味并且有膿性分泌物。對照組大鼠制作傷口采用相同操作，但不滴糞液。試驗組取紫草生肌膏擦洗大鼠創面后紗布包扎，對照組和模型組采用相同處理，包扎但不用生肌膏處理，換藥時用0.9%氯化鈉溶液清洗各組大鼠傷口，1次/d，連續干預14 d[7]。

1.2.3 大鼠創面動態血流值測定:激光多普勒血流儀檢測動態血流值，將探頭放置在創面上，選3個點，以肛瘺內口的頂端為第1個點，在瘺道走行方向上取第2和第3個點，每點記錄時間為30 s， 數據統計分析使用Power Lab Chart5 v5.2.2圖像分析軟件，該內口創面的血流值為3個點測量值的平均值[8]。

1.2.4 大鼠創面愈合率測定:大鼠創面愈合率測定在最后一次干預后測定創面愈合率，觀察并測定各組大鼠的創面愈合情況，創面愈合率=(原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積×100%[9]。

1.2.5 新生毛細血管數檢測:取各組大鼠肛管相近處的創面肉芽組織，依次采用甲醛固定，制備石蠟切片，經過CD31抗體染色，新生毛細血管在抗體標記后，用顯微鏡200倍下統計新生毛細血管數[8]。

1.2.6 大鼠創面肉芽組織HE染色:對各組大鼠創面肉芽組織進行固定包埋后切片，脫蠟覆水，蘇木精染色5 min，5%乙酸1 min，伊紅染色1 min，70%、80%、90%、100%乙醇各脫水10 s，二甲苯透明1 min，自然晾干再封片，于顯微鏡下觀察病理學特點[10]。

1.2.7 ELISA檢測大鼠創面肉芽組織炎癥因子:各組大鼠創面肉芽組織進行低溫勻漿，4 ℃ 2000 r/min 15 min離心后取上清液，加入酶標抗體，37 ℃,30 min，加入底物液，每孔100 μl,置37 ℃避光放置5 min,加入終止液顯色，每孔加入反應終止液50 μl終止反應,于20 min內測定實驗結果，酶聯檢測儀測定吸光度OD值，每組實驗設置3個復孔[11]。

1.2.8 Western blot 檢測創面肉芽組織TGF-β1/Smad蛋白的表達:對各組大鼠創面肉芽組織組織分離后進行液氮研磨，裂解蛋白后進行SDS-PAGE 電泳，電泳條件為80 V 15 min，120 V 2 h，轉膜120 V 2.5 h，一抗4 ℃過夜，二抗室溫1 h溫孵育后，曝光后采用photoshop軟件通過灰度值計算蛋白相對表達，測量灰度重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行分析，實驗獨立重復3次。計量資料以均數±標準差表示，符合正態分布并且滿足方差齊性數據采用雙尾獨立樣本t檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠創面愈合、血流及新生毛細血管情況比較 見表1。與對照組相比，模型組和試驗組大鼠創面愈合率、局部血流量、大鼠新生毛細血管數顯著降低，創面難愈，并且表面流膿、糜爛。試驗組大鼠創面愈合率、局部血流量、大鼠新生毛細血管數顯著提高，創面恢復優于模型組，但仍顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2 各組大鼠創面肉芽組織HE染色比較 對照組創面肉芽組織多被鱗狀上皮覆蓋，創面肉芽組織已成熟，毛細血管閉塞，成纖維細胞顯著增多,排列致密。模型組中性粒細胞大量滲出，未見片狀的膠原纖維沉積，創面肉芽組織生長較對照組和試驗組緩慢,成纖維細胞偏少,排列紊亂。試驗組創面肉芽組織成熟，部分毛細血管閉塞，小靜脈和小動脈初步形成，成纖維細胞增多并有序排列，偶見成片狀的膠原纖維沉積(圖1)。

表1 各組大鼠創面愈合、血流及新生毛細血管情況比較

圖1 各組大鼠創面肉芽組織病理圖(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠創面肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較 見表2。與對照組比較，模型組與試驗組炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均顯著上升(P<0.01)，而試驗組炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均顯著低于模型組，但仍顯著高于對照組(P<0.01)。

表2 各組大鼠創面肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較

2.4 各組大鼠創面肉芽組織成血管分化因子水平比較 見表3。與對照組相比，模型組與試驗組成血管因子VEGF、PDGF、AngⅡ、IGF-1R水平均顯著降低(P<0.01)，而試驗組成血管因子VEGF、PDGF、Ang Ⅱ、IGF-1R水平均顯著高于模型組，但仍顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠創面肉芽組織成血管分化因子水平比較

2.5 各組大鼠創面肉芽組織TGF-β1信號通路蛋白表達水平比較 見表4(圖2)。與對照組比較，模型組TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白水平均顯著降低；與模型組比較，試驗組TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白水平顯著升高，試驗組和對照組比較差異無統計學意義，蛋白質相對定量分析進一步驗證了這種趨勢(P<0.01)。

表4 各組大鼠創面肉芽組織TGF-β1信號通路蛋白表達水平比較

圖2 各組大鼠創面肉芽組織TGF-β1信號通路蛋白表達水平

3 討 論

肛瘺是肛門直腸瘺的簡稱，是肛門直腸周圍膿腫破潰或切口引流的后遺癥[12]。大多數是由肛管或直腸周圍的膿腫引起的，反復發作、自愈困難是肛瘺的特點。 肛瘺有間歇期和發作期。 在間歇期階段不需要藥物治療，在發作期間，可能會出現流膿、發紅、腫脹和疼痛等癥狀。 如果不能及時進行手術，通常采用藥物治療來暫時緩解癥狀[13-14]。紫草膏具有活血解毒、祛腐生肌的功效,對臨床上常見的瘡瘍流膿、糜爛、創面難愈、新肌難生具有良好的治療作用[15]。在深Ⅱ度燒傷患者治療中，紫草膏涂擦治療能明顯改善患者創面情況,通過調控血清5-羥色胺(5-HT)、β-內啡肽(β-EP)的表達水平提高創面愈合率。同時有研究表明三黃紫草膏輔助治療糖尿病足有助于創面的愈合,促進肉芽組織的生長,有效緩解疼痛,利于患者的康復。改良版紫草膏能改善局限性神經性皮炎的皮損厚度、色澤及瘙癢程度,同時具有改善表皮增厚、抗炎和促進表皮修復的作用[16-17]。本研究通過HE染色和ELISA實驗證實了紫草生肌膏可以促進肛瘺大鼠創傷組織修復，降低炎癥細胞的浸潤，同時降低組織細胞的IL-6、IL-8等炎癥因子釋放，發揮抗炎作用，降低了創傷組織的炎癥損傷。由于組織修復過程伴隨著組織內血管生成，本研究發現在紫草生肌膏干預后，大鼠創傷組織小靜脈血管和小動脈血管均有一定程度的增加，結合ELISA結果中證實的血管生成相關因子VEGF、AngⅡ等多種促血管生成因子釋放增加，可推測紫草生肌膏對創傷組織的保護作用可通過促進血管生成，促進組織修復實現。

傷口愈合是一個復雜的過程，它依賴于各種類型的細胞、生長因子、細胞因子和細胞外基質元素[18]。TGF-β1是調節細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，也是維持細胞內氧化還原穩態的中樞調節因子，在基質愈合過程中，主要由TGF-β的激活而轉化為可運動和收縮的肌成纖維細胞促進內皮細胞遷移和擴散愈合，每種TGF-β亞型可能對傷口愈合產生不同的影響，此過程通常取決于細胞的微環境，其中TGF-β1主要介導傷口的纖維化，TGF-β3可以促無瘢痕愈合，減少的瘢痕形成[19-20]。本研究表明，大鼠肛瘺發生后，TGF-β1、Smad3及p-Smad3水平顯著降低，提示傷口愈合能力下降，而紫草生肌膏干預后，大鼠創面肉芽組織TGF-β1、Smad3及p-Smad3水平顯著升高，提示紫草生肌膏可以通過TGF-β1促進傷口愈合，介導傷口纖維化，實現傷口的加速愈合，并且此過程與Smad蛋白的磷酸化修飾調控顯著相關，同時通過TGF/Smad通路抑制IL-6和TNF-α等炎癥反應[21-22]，發揮降低組織炎性損傷的作用。

綜上所述，紫草生肌膏對肛瘺大鼠創面愈合具有促進作用，其可以通過降低炎癥發應和促進血管生成發揮作用，此過程的分子機制與TGF-β1信號通路的調控及磷酸化修飾相關。本研究可以進一步通過細胞學實驗對該分子機制進行深入探究，完善紫草生肌膏在臨床應用的理論基礎。