鎘脅迫對玉米幼苗光合特性及活性氧代謝的影響

王金香，張阿良，秦 敏，曹江梅，陳 文，郭瑞瑞

（山西大同大學 農學與生命科學學院 山西大同大學設施農業技術研發中心，山西 大同 037009）

由于人類對鎘（Cd）的開發、冶煉、加工和利用，大量的Cd不可避免被排放到空氣、水和土壤當中，造成嚴重環境污染。2014年全國土壤調查結果顯示，Cd污染超標率達到7%。鎘離子（Cd2+）易溶于水、毒性強且不易被降解，會通過根系被植物不斷吸收并通過食物鏈傳遞積累到不同生物體中，更加劇了對生態系統和人類的威脅。

作為一種植物非必需重金屬元素，Cd2+會抑制發芽水稻種子中淀粉酶活性，減少種子萌發所需的物質和能量，降低種子發芽率并影響幼苗的后續生長[1-2]。大蒜根系受到Cd2+脅迫后出現質壁分離現象，細胞壁明顯增厚，細胞器嚴重受損，細胞液泡化程度提高，核質高度凝集[3]。高濃度Cd2+能造成水稻根毛細胞膜的去極化，影響質膜上K+通道開放，導致根系內K+外滲，造成K元素缺失和離子失衡，影響根對水分和礦物質的吸收和運輸[4]。Cd2+的存在同樣影響葉片的發育，導致氣孔數量減少、氣孔閉合率發生變化，葉綠素的合成受阻、葉綠體結構破壞，引發葉片枯黃失綠，植株的生長被抑制[5-6]。高濃度Cd2+抑制小麥旗葉的生長，直接或間接影響到開花相關基因的表達，對植物的開花和成花過程產生毒性效應，造成小麥籽粒產量下降和Cd2+含量超標，最終影響植物的產量和品質[2,7]。

玉米是中國北方地區主要的糧食作物，種植范圍廣、生物量大，具有較強的Cd2+吸附能力。但玉米幼苗生長期對Cd2+十分敏感，是最先受土壤Cd2+污染危害的階段。宇克莉等[8]報道，高濃度Cd2+處理后玉米幼苗生長受到明顯抑制，細胞膜系統破壞明顯，細胞器損傷嚴重。劉建新等[9]研究證實，Cd2+脅迫不僅抑制幼苗的生長發育和干物質積累，而且會影響抗氧化酶活性，打破機體的氧化代謝平衡，引起生物毒性。本研究將進一步探討玉米苗期Cd2+的積累，葉綠素、凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和葉間CO2濃度（Ci）與Cd2+變化的相關模式，探索不同Cd2+濃度對幼苗葉片抗氧化酶系統及抗氧化物質、活性氧生成、膜脂過氧化的影響，以揭示Cd2+脅迫對玉米光合特性和活性氧代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料與設計

挑選顆粒飽滿、大小一致的玉米種子（ZeamaysL.，‘農大108’）經次氯酸鈉浸種、清水漂洗后放到培養盤中，在25℃恒溫培養箱遮光萌發24 h，選取發芽一致種子放于盛有Hoagland營養液的圓形塑料盆中水培生長，光照強度200μmol·m-2·s-1和溫度28℃/22℃（14 h/10 h）（晝/夜）。每盆放置20粒種子，每2 d更換1次營養液。當第3片葉片完全伸展時，幼苗分別用0、100、200、400μmol·L-1CdCl2溶液中處理72 h，每組設3個重復。

1.2 測定方法

將幼苗根部用水沖洗干凈后，取根、莖、葉，剪碎后微波消解儀進行消化，用火焰原子分光光度計測定組織中Cd2+含量，生長量測定用烘干稱質量法。葉綠素含量測定參照文獻[10]。葉片光合特性采用Yaxin-1102便攜式光合蒸騰儀測定，在室外對玉米第三片葉Pn、Tr、Gs和Ci測定，每天11:00—14:00進行測定，天氣條件：晴天，室外溫度為21～23℃，每個處理選3株幼苗測定。

SOD活性、CAT活性和H2O2含量測定采用Jiang等方法[11]。H2O2組織化學染色法采用3,3-二氨基聯苯胺（DAB）染色法檢測[12]；GSH含量測定采用二硫代雙二硝基苯甲酸（DTNB）方法[13]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[14]。

1.3 統計分析

用SPSS22.0統計軟件，采用單因素ANOVALSD和Duncan’s多重比較檢驗法對數據進行分析處理，結果為3次獨立試驗平均值±標準差，不同小寫字母表示P＜0.05水平差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鎘在幼苗組織中的積累

如表1所示，與對照相比，處理組根、莖和葉中Cd2+的含量極顯著增加。根中，100μmol·L-1處理組Cd2+積累量最大，但處理組間無差異。莖中，3個處理組Cd2+均低于同處理組根的積累，且隨Cd2+濃度增加，積累量增加，但組間無顯著差異。葉中，Cd2+的積累量均低于同處理組根和莖的量，400μmol·L-1處理組Cd2+的積累量最多，200μmol·L-1處理組最少。

表1 玉米幼苗根、莖、葉中Cd2+的積累（72 h）

2.2 鎘對幼苗形態和葉綠素含量的影響

如圖1-A所示，對照組幼苗生長旺盛，植株挺立，葉片伸展，葉色鮮綠；100μmol·L-1Cd2+處理后葉片缺水，半數葉片下垂、皺縮，少數葉色發黃；200μmol·L-1Cd2+引起多數葉片下垂、皺縮，葉片失水嚴重，少數葉色失綠變黃；當Cd2+濃度達到400 μmol·L-1，全部葉片都出現下垂、萎蔫，大多數葉色發黃，整個植株枯萎。從圖1-B可以看出，Cd2+處理顯著降低葉片中葉綠素含量，其中Cd2+濃度越高、處理時間越長，葉片中葉綠素含量越低；在72 h，3個處理組葉綠素含量顯著下降，分別是對照組的68%、40%、29%。由圖1-C可知，Cd2+處理后植株干物質積累顯著下降，且濃度越高干物質積累越少，但處理組間無差異。

圖1 Cd2+處理對玉米幼苗形態、葉綠素含量和單株干質量的影響

2.3 鎘對幼苗葉片光合特性的影響

如表2所示，與對照組相比，Cd2+處理后幼苗葉片的Pn、Tr和Gs均顯著降低，同時Pn、Tr和Gs與Cd2+濃度和處理時間無明顯相關性，400μmol·L-1Cd2+處理72 h后Pn、Tr和Gs僅為對照的2.7%、5.8%、5.1%。葉片Ci變化趨勢與Pn、Tr和Gs的變化相反，Cd2+處理后Ci顯著增加，但無濃度和時間效應，在400μmol·L-1Cd2+處理72 h后Ci為對照的368%。Cd2+處理引起玉米葉片氣孔降低，抑制光合作用和蒸騰作用，葉間CO2濃度升高。

表2 Cd2+處理對幼苗葉片光合特性的影響

2.4 鎘對幼苗葉片中抗氧化酶和GSH含量的影響

如圖2-A所示，與對照相比，Cd2+處理幼苗24 h后3個處理組SOD活性顯著升高，分別是對照組的167%、160%、179%；處理48 h，除低濃度組（100 μmol·L-1）持續保持高活性外，中高濃度組（200、400 μmol·L-1）SOD活性逐漸下降；當處理時間延長至72 h，SOD活性全部低于對照組。由圖2-B可知，Cd2+引起葉中CAT活性先升高后降低，低濃度和中濃度處理組CAT活性在48 h達到最大值，為對照的293%、242%，72 h后活性顯著下降，中濃度組低于對照；高濃度組CAT活性在24 h到達最高，是對照的208%，之后活性顯著下降，在72 h低于對照組。由圖2-C可知，與對照相比，Cd2+處理組GSH含量均出現顯著降低，且Cd2+濃度越高、處理時間越長，GSH含量越低；在72 h，3個Cd2+處理組GSH含量分別是對照的27%、21%、19%。GSH含量與Cd2+濃度和處理時間呈負相關性。

圖2 Cd2+處理對葉片SOD活性（A）、CAT活性（B）和GSH含量（C）的影響

2.5 鎘對葉片H2O2和MDA含量的影響

DAB與H2O2反應形成棕色復合物，棕色復合物量與H2O2含量成正比。如圖3-A所示，對照組，只在葉的基部有少量棕色沉積物，但Cd2+處理后葉片中棕色復合物沿葉脈大量出現、顏色顯著加深，說明正常生長的幼苗，葉片中H2O2含量少，但Cd2+處理后，H2O2大量積累。由圖3-B可知，Cd2+處理后葉片中H2O2含量迅速增加，且Cd2+濃度越高、處理時間越長，H2O2含量越多；在72 h，處理組葉片中H2O2含量分別比對照增加163%、169%、185%。從圖3-C可以看出，對照組MDA含量在整個試驗過程中都處于一個較低的水平，而受到Cd2+處理后葉片MDA含量明顯升高，并且具有濃度和時間效應。

圖3 Cd2+處理對葉片中H2O2積累和MDA含量的影響

3 討論與結論

根是土壤Cd2+進入植物的第一道屏障，它可沿著細胞壁的空隙運輸進入木質部，或與膜上的轉運蛋白（如Fe2+轉運載體、Ca2+通道以及Zn2+/Fe2+調控蛋白ZIP家族中的ZIP8和ZIP14等）結合進入根毛表皮細胞、或與根部分泌的小分子化合物如麥根酸等螯合通過YSL(yellow stripe like)蛋白進入根細胞，之后借助于細胞間的胞間連絲，經皮層、內皮層及周鞘進入根內導管細胞[15]。高溶解性的Cd2+借助于水的流動由地下向地上部分移動并進入到植物的莖和葉中。在本試驗中急性Cd2+脅迫后大量Cd2+進入幼苗中，積累量是對照的37～42倍，其中67%以上積累在根部，莖次之，葉中積累最少。這種Cd2+在組織中的分布特點與大豆植株一致，既根系吸收和固定Cd2+能力最強、秸稈次之、葉和果實的吸收最低[16]。水稻幼苗中Cd2+的積累同樣主要聚集在根部質外體空間，枝條中Cd2+的量遠低于根中的量。Cd2+在組織中的積累特點與根的結構有極大關系，內皮層細胞壁上凱氏帶作用導致質外體大部分Cd2+與細胞壁結合滯留在根部，其次根部植物螯合素、GSH、金屬硫蛋白等含巰基物質在根中快速積累，共質體中大部分Cd2+與巰基結合，被限制在根部[17]。根系通過沉淀、絡合和隔離作用富集大量Cd2+，進而減少Cd2+向地上部分的運輸。隨著Cd2+脅迫濃度和時間的持續增加，根的負荷超載，細胞內結合態的Cd2+含量占比開始降低，胞內可溶性組分中Cd2+含量占比升高，Cd2+遂由根經莖向葉中運輸和積累[18]。

葉片是植物光合、蒸騰作用等重要生命活動發生的主要器官，雖然葉片中Cd2+的積累較少，但葉片對Cd2+的敏感度更高。葉綠體是進行光合作用的場所，葉綠素對光能的捕獲和傳遞是光合作用的關鍵起始，其含量是植物光合作用能力和光合器官生理狀況的重要指標。氣孔是植物葉片與大氣進行氣體交換和水分蒸發的主要通道，其閉合程度直接影響光合作用、蒸騰作用及植物對水分和無機鹽的吸收。葉綠素、Pn、Tr和Gs及Ci是幼苗長勢和進行產量影響評估的基礎。孫亞莉等[19]研究發現，Cd2+脅迫條件下，水稻葉片葉綠素含量、Pn、Gs、Tr和Ci均出現下降趨勢。在本試驗中Cd2+脅迫幼苗后，整個植株葉片低垂皺縮、葉色變黃，葉綠素含量明顯減少且干物質積累減少；光合相關的指標Pn、Tr和Gs都顯著下降，不及對照的10%，但與水稻幼苗不同的是Ci反向升高。與玉米表現一致的還有小麥，在受到Cd2+脅迫后其幼苗葉片光合色素含量、葉綠素熒光相關指標都出現下降[20]。惠俊愛等[21]報道，Cd2+影響葉綠素前體的合成，促進更多的ROS在細胞中增加，參與葉綠素的降解，降低葉綠素含量，造成植物失綠變黃。而且Cd2+的存在影響了保衛細胞中的K+、Ca2+等離子濃度和脫落酸，從而影響了氣孔的開關，使Gs下降、Tr降低[21]。高濃度Cd2+脅迫下葉綠素含量下降、葉綠體膜結構破壞和類囊體的垛疊程度降低均使電子傳遞鏈受阻，PSⅡ光化學效率降低[20,22]；同時葉片更通過關閉氣孔和減少CO2吸收（碳同化）從而降低了Pn來減緩植物的生長速度，干物質積累減少。由于Cd2+對Pn的高抑制率（95%以上），導致細胞間CO2利用效率降低，脅迫過程中呼吸速率的加快，造成細胞間CO2的累積，使胞間CO2濃度上升。

H2O2積累是重金屬毒性的主要原因之一，H2O2積累及隨后造成的氧化脅迫和細胞的損傷是Cd2+誘導的生物毒性之一。蠶豆和姜幼苗在受到Cd2+處理時O2·—自由基生成速率和H2O2含量顯著升高，膜脂過氧化水平加劇[8,9,23]。SOD催化O2·—自由基歧化生成O2和H2O2，CAT可將H2O2水解，2種酶前后依次作用將ROS清除。螯合肽(PCs)的合成是植物應對重金屬脅迫的一種適應性反應，重金屬與PCs螯合并轉移至液泡中貯存，從而達到解毒效果。GSH是合成PCs的前體，一方面GSH本身攜帶有巰基，巰基可以和重金屬結合降低細胞毒性，或合成PCs起到解毒的功效；同時，GSH中巰基又具有抗氧化作用，可還原自由基，降低對細胞產生的氧化損傷。高Cd2+環境中，SOD和CAT的活性表現及GSH含量的變化直接與細胞中H2O2積累及是否產生氧化脅迫相關，并最終影響個體存活。在本試驗中對照組SOD、CAT活性和GSH含量都相對穩定，機體處于一個相對穩定的內環境，ROS水平低，氧化還原狀態處于動態平衡。在Cd2+脅迫條件下SOD和CAT活性都出現先升高后下降的變化趨勢，而且2種酶活性最大峰值出現時間與Cd2+濃度有緊密關系，低濃度組較高濃度組抗氧化酶活性峰值出現時間晚，并且峰值之后活性下降速度慢，表現為100μmol·L-1Cd2+脅迫組，SOD活性在48 h時達到最大，而200、400μmol·L-1Cd2+脅迫組，活性在24 h即達到峰值；CAT活性峰值出現的時間也隨Cd2+濃度升高由48 h（100/200μmol·L-1組）前移至24 h（400μmol·L-1組）；并且CAT活性比SOD持續時間更長，即機體在受到脅迫后SOD活性在24 h快速升高（活性提高59%～80%），48 h除低濃度組活性（提高70%）保持略有上升外，其余兩個濃度組均快速下降（-42%，-22%），而CAT活性在24 h升高（活性提高30%～100%），48 h活性進一步上升了192%、142%、16%。機體最先啟動SOD反應，將O2·—自由基分解產生H2O2和O2；當SOD活性最高時，機體中因SOD作用而產生大量H2O2，此時必須調控機體CAT活性不斷升高，才能將大量H2O2分解，實現降低ROS功能。抗氧化物質GSH含量在Cd2+脅迫后出現下降，并且Cd2+處理時間越長、濃度越高GSH含量越低。這可能是Cd2+脅迫促進還原型谷胱甘肽（GSH）轉化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）,激活ASA-GSH循環，在植物對Cd2+的吸收轉運、累積與解毒中發揮重要作用[24]。

在正常生理情況下，植物體內活性氧可維持于有利無害的極低水平。短時間低濃度的Cd2+脅迫過程中植物抗氧化酶活性多出現適應性上升，同時抗氧化物質對離子的螯合和協同抗氧作用可以清除因脅迫而產生的多余ROS，維持機體氧化平衡，保持幼苗的正常生長和發育。而Cd2+濃度或脅迫時間一旦超過一定閾值，抗氧化酶活性被抑制，GSH系統抗氧能力下降，則ROS的產生速率大于其清除速率，機體中ROS含量升高，造成生物大分子（如脂類物質等）氧化損傷，進而引起細胞功能紊亂。姜對Cd2+較短期（40 d）脅迫或較低濃度Cd2+脅迫具有適應性，但脅迫120 d或過高濃度的Cd2+脅迫嚴重損傷了姜葉片抗氧化系統，使活性氧代謝失調，葉片膜系統遭到嚴重傷害[9]。本研究顯示，正常生長的玉米幼苗，葉中H2O2含量都維持在一個相對較低的水平；隨著Cd2+脅迫時間延長，葉中H2O2含量迅速增加，且MDA含量增加也說明ROS的積累已引發膜脂過氧化反應，造成膜結構破壞，植物光合作用和蒸騰作用停止。因此，幼苗葉片中MDA大量生成與Cd2+積累量的升高和H2O2積累相伴出現，加劇了幼苗生存的危機。

玉米幼苗在受到Cd2+脅迫后，根、莖和葉中Cd2+快速積累，積累量根＞莖＞葉；Cd2+引起葉綠素含量、Pn、Tr和Gs急劇降低，Ci顯著升高，葉片萎蔫，且Cd2+濃度越高對植株的破壞力越強；機體抗氧化酶（SOD和CAT）及抗氧化物質（GSH）在脅迫早期抗氧化能力增強，；但當Cd2+濃度增加和脅迫持續進行時，葉片抗氧化力下降，葉中H2O2代謝失衡，脂質發生過氧化反應，葉片結構破壞，功能喪失。