血清TLR4 水平與肺癌化療后骨髓抑制的 相關性分析

劉夢瑤 羅蓮 陳梓林 顏磊 周娜 陳勇

肺癌是發生于肺部的惡性腫瘤,其發病率與病死率近年來均排在我國惡性腫瘤的第1 位。多數患者出現癥狀時已經到了晚期,失去最佳治療的時機。以鉑類為基礎的聯合用藥依舊是當下治療非小細胞肺癌患者的主要方案［1,2］。骨髓抑制是臨床上化療最常見的劑量限制副反應?；煏拇罅康墓撬枳婕毎?出現骨髓纖維化、抑制成熟血細胞釋放、骨髓功能抑制等,患者發生骨髓抑制后可能出現疲勞、出血、發熱等癥狀,導致治療延遲、減少藥物劑量等,均會影響治療效果,增加治療成本［3-5］。血清TLR4 是重要的先天免疫的受體之一,TLR4 及其相關信號參與了造血穩態和造血疾病發?。?,7］。因此考慮TLR4 參與了化療后骨髓抑制的相關機制。故本文將邵陽市中心醫院2022 年1～8 月收治的93 例非小細胞肺癌患者作為研究對象,探討血清TLR4 與化療后骨髓抑制的相關性,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022 年1～8 月邵陽市中心醫院收治的93 例非小細胞肺癌患者,年齡40～80 歲；病理類型：鱗狀細胞癌55 例,腺癌38 例；臨床分期均采用TNM 分期第8 版。本研究經醫院倫理委員會審批通過,所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入標準 ①病理學檢查確診為非小細胞肺癌；②病歷資料完整；③化療方案為鉑類為基礎的雙藥化療；④充分的骨髓造血功能；⑤體力評分>70 分；⑥血常規、心肌酶學、肝腎功能、凝血功能等未見明顯異常。

1.3 排除標準 ①合并其他惡性腫瘤患者；②有凝血功能障礙、血液系統疾病、風濕免疫系統疾病、內分泌系統疾病等患者；③合并其他感染性疾病患者；④合并精神疾病或癡呆患者；⑤合并骨轉移患者；⑥有化療禁忌證,合并其他器官功能損傷不能接受化療的患者。

1.4 方法

1.4.1 臨床資料收集 利用病歷系統收集患者年齡、性別、病理類型、體質量指數等資料。

1.4.2 血常規 采集患者清晨6 點的外周血,選擇全自動血液分析儀檢測血常規。

1.4.3 TLR4 血清水平 采集患者清晨6 點外周靜脈血,離心得血清。運用人酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司)檢測血清TLR4水平。標準品的加樣: 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl。加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl,然后再加待測樣品10 μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部。加酶:每孔加入酶標試劑100 μl,空白孔除外。溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60 min。配液:將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍 稀釋后備用。洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s 后棄去,如此重復5 次,拍干。顯色:每孔先加入顯色劑A 50 μl,再加入顯色劑B 50 μl,37℃避光顯色15 min。終止:每孔加終止液 50 μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。測定:以空白孔調零,460 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

1.5 觀察指標及判定標準

1.5.1 骨髓抑制發生情況 骨髓抑制分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級,判定標準見表1。其中0 級代表無,Ⅰ+Ⅱ級代表輕度,Ⅲ+Ⅳ級代表重度。

表1 骨髓抑制判定標準

1.5.2 化療前后血清TLR4 水平 酶聯免疫吸附測定法實驗結果判讀：用標準品濃度與OD 值計算出標準品的直線回歸方程式Y=-3.503+96.340X,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差 ()表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗,等級資料采用秩和檢驗；相關性采用Spearman 相關分析。化療前后TLR4 水平比較運用直線相關分析。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨髓抑制發生情況分析 93 例中晚期非小細胞肺癌患者中共發生骨髓抑制78 例(83.9%),其中0 級 15 例(16.1%),Ⅰ級21 例(22.6%),Ⅱ級40 例(43.0%),Ⅲ級11 例(11.8%),Ⅳ級6 例(6.5%)。

2.2 臨床特征分析 患者年齡<65 歲、體質量指數<18.5 kg/m2的骨髓抑制程度與年齡≥65 歲、體質量指數≥18.5 kg/m2比較,差異有統計學意義(P<0.05)；不同性別、KPS 評分、病理分型的骨髓抑制程度比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 臨床特征分析(n)

2.3 化療前后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度的相關性分析 化療前,患者血清TLR4+的骨髓抑制程度與血清TLR4-比較,差異無統計學意義(P>0.05)；化療后,血清TLR4+的骨髓抑制程度與血清TLR4-比較,差異有統計學意義(P<0.05)；化療后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度呈正相關(r=0.540,P<0.05)。見表3,表4,圖1。

圖1 化療前后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度的相關性分析

表3 化療前血清TLR4+與血清TLR4-骨髓抑制程度比較(n)

表4 化療后血清TLR4+與血清TLR4-骨髓抑制程度比較(n)

3 討論

國家癌癥中心數據顯示,我國肺癌發病率及死亡率逐年上升。化療聯合其他治療的綜合方案依舊是目前非小細胞肺癌的主要治療手段［8］。骨髓抑制是化療主要的劑量限制性副反應,不僅會引發患者貧血、發熱等,更會影響患者治療效果［9］。

免疫系統是由復雜的分子和細胞機制組成,先天免疫是身體機能抵御內外部威脅的第一道防線?；趯ξ⑸锊≡嚓P分子模式(PAMPs)、損傷相關的分子模式(DAMPs)和適應性免疫的認識,并通過產生大量因子介導由B 細胞主導的免疫活動［10］。先天免疫的主要分子傳感器是模式識別受體(PRR),這是一種大蛋白類別,其中最重要的是血清Toll 樣受體［11］。血清TLR4 是先天免疫的受體之一,在脂多糖(LPS)刺激下誘導下游因子聚集激活,最后能夠促進促炎因子的表達,包括白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)等［12］。據報道,在暴露于LPS 或細菌后,血清TLR4 可發出依賴于非造血細胞的信號傳導,如內皮細胞,其分泌粒細胞集落巨噬細胞刺激因子 (G-CSF),可通過誘導祖細胞進入骨髓譜系刺激粒細胞前體增殖的細胞因子,從而促進粒細胞的生成［13-15］。血清TLR4 可以在缺血、組織損傷和在病原體不存在或存在的創傷下激活。血清TLR4 主要的DAMPs 包括纖連蛋白、纖維蛋白原、熱休克蛋白70、氧化的低密度脂蛋白、透明質酸片段等［16］。TLR4 上調受照射的骨髓細胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox2)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)的表達并促進粒細胞生成。此外,血清TLR4 可防止骨髓微環境中脂肪組織的形成以及輻射引起的造血微環境的破 壞［17,18］。據研究,在體內LPS 與血清TLR4 的相互作用可直接誘導造血干細胞(HSC)增殖；然而長時間LPS 暴露會削弱HSC 的自我更新和再增殖活動［19］。骨髓異常增生綜合征患者的造血干細胞/祖細胞(HSPC)不僅會增加血清TLR4 的表達,還會對TLR4 的配體更加敏感。分泌的內源性DAMPs 與血清TLR4 和髓樣細胞受體髓系細胞分化抗原(CD33)結合,并通過HSPC上的直接和間接作用促進骨髓增生異常綜合征(MDS)中的無效造血［20］。此外,刺激血清TLR4 信號傳導可能對急性髓系白血病具有治療效果。血清TLR4 激動劑可促進髓母細胞的死亡和分化,直接促進急性髓細胞性白血病(AML)的細胞死亡和分化［21］。

在臨床上HSPC 獲取困難,難以擴大應用。目前臨床上對于化療后骨髓抑制的診斷及檢驗依舊采用外周血樣本。然而,雖然外周血細胞源于骨髓HSPC,但外周血細胞中各表達指標是否參與化療所致骨髓抑制的發生機制正是本研究旨在探討解決的問題。本實驗以外周血清為標本,運用酶聯免疫吸附測定法測定外周血中TLR4 的表達水平,結果顯示,化療后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度呈正相關(r=0.540,P<0.05)?；熐昂笱錞LR4 水平的變化考慮為化療引起的組織損傷,釋放內源性損傷因子,激活TLR4 的表達,促進先天免疫系統的促炎反應,通過下游反應鏈引發炎癥反應。骨髓抑制程度與血清TLR4 水平相關,可能為骨髓組織中的骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)等細胞上的血清TLR4 激活,可促進HSPC 分化,分化相關血液細胞后釋放入血,減輕患者骨髓抑制程度。

綜上所述,血清TLR4 水平與非小細胞肺癌化療后骨髓抑制存在相關性,TLR4 可能參與了化療后骨髓抑制的發生機制。但本研究樣本量較小,化療周期為 1 次,運用的是外周血標本,實驗結果的說明性有限,尚需進一步擴大樣本量進行前瞻性研究,明確TLR4 與化療骨髓毒性的具體機制,從而指導骨髓抑制的早期防治和優化治療方案選擇。