柑橘主要遺傳性狀的分子標記研究進展

茍文濤 曾莎芮 張志標 陶星星 卓國寧謝岳昌 馬瑞豐 杜小珍 李國華

（1 梅州市農林科學院，廣東梅州514071；2 梅州市農林科學院果樹研究所，廣東梅州514071；3 國家柑橘產業技術體系梅州沙田柚綜合試驗站，廣東梅州514071；4 廣東省梅州柚品質改良工程技術研究中心，廣東梅州514071）

柑橘（Citrus reticulataBlanco.）屬蕓香科柑橘屬，由于其品種繁多、形態各異、口感和風味多樣，能滿足各類人群的需要，在市場上廣受消費者青睞[1-2]。根據聯合國糧農組織FAOSTAT 數據顯示，2022 年我國柑橘園面積為303.3540 萬hm2、柑橘產量為6003.89 萬t（約占全球總產量1/3 左右）[3]，國家統計局發布（http：//www.stats.gov.cn/sj/）數據顯示中國柑橘栽培面積及柑橘產量常年穩居世界首位。在如此產業背景下，我國的柑橘育種研究得到迅猛發展，種質資源不斷創新且數量逐年增加。柑橘是高經濟附加值的農作物之一，對提高農民的收入具有重要意義。

柑橘常規育種年限長、效率低且成本高，目前國內的柑橘育種以傳統的芽變育種和雜交育種技術為主，分子標記育種還處在起步階段，未建立完善的柑橘分子標記輔助育種體系。隨著近些年分子標記技術迅猛發展，分子標記輔助育種技術（MAS，Marker assisted selcection）為品種創制和選育工作提供了創新思路[4]。分子標記技術以不同物種間核苷酸序列為基礎，開展個體間基因差異研究，是解決生物鑒定難的重要手段，其鑒定結果穩定，在精準鑒定易混淆品種近緣種方面具有明顯優勢。分子標記技術彌補了柑橘類育種研究領域發展的技術短板，在柑橘種質資源鑒定、系統進化、遺傳多樣性和分子育種等方面能夠發揮重要作用。

1 DNA 分子標記技術的概述及類型

DNA 分子標記技術是20 世紀60 年代繼形態標記、細胞標記和生化標記之后發展起來的以遺傳物質（核酸）的多態性為基礎的遺傳標記形式[5]。因其不受植物內部因素（組織類別、發育階段）和外部環境條件的限制，還具有數量多、分布廣、多態性高、穩定性好、檢測迅速、操作簡便等諸多優勢，因而被廣泛應用到植物遺傳多樣性分析、品種鑒定、親緣關系分析、基因定位等方面[6]。

根據對DNA 多態性的檢測方法不同，可將分子標記技術分為4 類[7]：一是基于分子雜交技術的分子標記，如限制性片段長度多態性標記（RFLP，Restriction fragment length polymorphism）、 可 變數目串聯重復多態性（VNTR，Variable number of tandem repeat）等；二是基于PCR 的分子標記，如隨機擴增多態性DNA（RAPD，Randomly amplified polymorphic DNA）、特征性片段擴增區域（SCAR，Sequence characterized amplified regions）、簡單重復序列（SSR，Simple sequence repeats）、簡單序列重復區間擴增多態性（ISSR，Intersimple sequence repeat）、相關序列擴增多態性（SRAP，Sequence related amplified polymorphism）等；三是基于PCR 與限制性酶切技術結合的分子標記，如擴增片段長度多態性（AFLP，Amplified fragment length polymorphism）、酶切擴增多態性序列（CAPS，Cleaved amplified polymorphic sequences）等；四是以DNA 序列分析為基礎的分子標記，如內轉錄間隔區（ITS，Internal transcribed spacer）、轉錄單位間隔區（IGS，Intergenic spacers）、單核苷酸多 態 性（SNPs，Single nucleotide polymorphisms）等。目 前，RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP、SCAR以及SSR 等分子標記技術在柑橘研究中均有報道。

2 DNA 分子標記技術在柑橘中的應用研究

柑橘是一種重要的經濟作物，其重要性狀包括果實品質、植物生長和抗逆性等。DNA 分子標記技術可用于開發與控制果實品質、植物生長和抗逆性的基因位點相關的分子標記。這些分子標記可以用于選擇具有優良性狀的柑橘植株，提高育種效率。總之，分子標記開發是柑橘遺傳學研究的重要手段，有助于揭示柑橘重要性狀的遺傳基礎，為育種提供指導，促進柑橘遺傳改良和品種培育。

2.1 柑橘外在品質相關的分子標記柑橘的外在品質性狀除了胚型、花藥顏色以外，果實形狀、大小和色澤等相關性狀是由多基因控制的數量性狀，受到內外多種因素的影響，研究難度較大，目前關于其遺傳調控的機制尚不清楚[8]。然而，果實大小是柚類的最重要農藝性狀之一，不僅影響柚的產量和外觀品質，也影響生產成本和消費者的選擇。長期以來柚果的外觀品質已成為果實品質評價和售價的主要參考指標。Imai 等[9]研究發現，柑橘果實大小介于150～300g 范圍內，是理想的柑橘果實大小育種目標。García 等[10]對Citrus volkameriana×Poncirus trifoliata 雜交群體進行遺傳分析，檢測到Fs1、Fs2和Fs3等3 個與柑橘單果重相關的QTL 位點；Yu等[11]對Fortune 橘×Murcott 橘橙雜交群體進行遺傳分析得到48 個與果實品質相關的QTL，其中FW4.2、FW5.1和FW8等3 個QTL 與果實大小相關。羅艾等[12]通過晚蜜2 號×梨橙2 號的94 株F1材料為分離群體探究柑橘果實大小與質量的遺傳調控機制，定位到4 個與果實質量相關的QTL，3 個與橫徑相關的QTL，4 個與縱徑相關的QTL，都分別位于WL3 和WL8 連鎖群上。在果皮果肉顏色方面，近年來，張亞飛等[13]從柑橘全基因組中鑒定出的CcCCD4a基因與柑橘果肉顏色高度相關，其表達量的高低與果肉顏色深淺變化呈負相關關系。湯雨晴等[14]以紅橘與枳雜交F1群體為材料，對果肉色澤和類胡蘿卜素代謝進行QTL 分析，定位到與柑橘果肉色澤相關的8 個QTL 位點，并篩選出與色澤高度相關的候選基因Ciclev10019730m和Ciclev10021268m。苑平等[15]利用SRAP 分子標記從克里曼丁紅橘芽變植株中克隆到具有差異序列的基因Cs4g12370，推測其可能與果皮色澤調控有關。

2.2 柑橘內在品質相關的分子標記目前，評價柑橘內在品質的指標有香味、苦味、酸味、甜味和質地等[16]。這些風味屬性在一定程度上受內源性化學物質影響，如揮發性物質含量決定香味的濃度，類黃酮和檸檬苦素類似物決定果實的苦味，可溶性糖含量決定果肉的甜味，有機酸含量影響果汁的酸味，木質素、果膠、纖維素和半纖維素的含量影響果實的化渣率，氨基酸和異味的醇、醛等物質影響果實的鮮味[1]。隨著人們生活水平的提高，市場對不同風味的柑橘需求日益凸顯，前人也對柑橘風味進行了一定程度的研究。Asins 等[17]在C.clementinaHort×C.tangerinaHort 群體中，將果實含糖量性狀控制位點鎖定在9 號連鎖群，在可溶性固形物含量和酸度之間存在相關性的情況下，在連鎖群9b 和4b 中檢測到了2 個性狀的QTL，但沒有發現QTL 的聚類，這表明連鎖至少部分地解釋了相關性。張亞飛[18]對柑橘果實GWAS 分析，研究發現CcGLDH與柑橘果實苦味、糖含量、酸含量以及果皮果肉顏色有著緊密的關聯。Kita 等[19]以溫州蜜柑、葡萄柚、臍橙和酸橙等材料進行苦味調控機理探究時發現LGT基因與苦味性狀相關聯，進一步研究發現CitLGT-2可以延遲溫州蜜柑中的苦味，而CitLGT-1等位基因則可以延遲臍橙果實中的苦味。Fang 等[20]對不同柑橘品種果實酸度進行檢測，在無酸柚6 個不同雜交群體中開發了3 個不同的RAPD 連鎖標記。江東等[21]通過對低酸和高酸柚群體的Fst 和XPCLR 選擇性清除分析，進行柚類果實中決定檸檬酸含量基因的初步定位，定位到7 號染色體上與可滴定酸含量顯著關聯的SNP 位點。

3 柑橘主要病害相關的分子標記

柑橘病害是導致產量損失和品質下降的主要原因之一。分子標記輔助育種為培育抗病性強、產量高、品質好的品種提供了新的可能性。例如，利用與抗病性相關的分子標記，可以幫助育種家在較短時間內篩選出具有良好抗病性的柑橘品種。近年來，隨著各柑橘產區種植面積不斷擴大，廢棄果園清理不善，柑橘病害日益凸顯。同時柑橘極易感染一種或多種病害，從而使得植株生長發育受阻、產量降低、果實品質下降，甚至導致植株死亡。目前，世界上已報道的柑橘病毒和類似病毒病約有80 余種，多具有易傳播、危害性大、多種病原復合侵染率高、感染后樹體終身帶毒和難以防治等特點[22]。我國柑橘常見且危害較大的病害有柑橘黃龍病（HLB，Cirtus huanglongbing）、柑 橘 衰 退 病（CTV，Citrus tristeza virus）和柑橘潰瘍病（CBC，Citrus bacterial canker）等[22]。這些病害不但通過苗木轉運和芽條嫁接引種進行遠距離傳播，而且還能在田間通過農事操作和昆蟲等進行近距離擴散。目前，針對柑橘病毒類病害尚無有效的防治措施，本文通過對柑橘病毒病相關的分子標記研究進展進行概述，為柑橘病毒病的快速診斷和抗病性研究提供參考。

3.1 黃龍病分子標記柑橘黃龍病是一種嚴重影響柑橘產業的重要病害，給全球柑橘產業帶來了巨大的損失。為了應對柑橘黃龍病的威脅，研究者們正在努力探索與之相關的分子標記。Chen 等[23]首次利用簡單重復單位（AGACACA）證明了佛羅里達州和中國廣東省黃龍病菌株存在顯著差異。Katoh 等[24]利用可變數目的串聯重復序列（VNTR，Variable number of tandem repeats）構建黃龍病的SSR 標記，成功篩選到27 個具有4～63 個核苷酸的SSR 分子標記，為黃龍病遺傳多樣性研究奠定基礎。Matos 等[25]用其中4 個SSR 分子標記分析黃龍病新流行區的菌株，發現佛羅里達州南北的菌株存在差異。Ming 等[26]在枳遺傳圖譜LG6、LG8 和LG9 以及甜橙遺傳圖譜LG7 上，分別鑒定到4 個HLB 誘導葉片和冠層反應的QTL，揭示多個QTL參與柑橘HLB 反應的遺傳控制，為今后研究HLB抗性或耐受性的遺傳結構提供了一個起點。目前，對于柑橘黃龍病分子標記的研究還處于初級階段，尚未有成熟的分子標記應用于育種實踐。未來的研究需要進一步探索這些基因及其作用機制，以便更好地理解柑橘黃龍病的發病機理，并找到更有效的育種策略來應對這種病害的威脅。

3.2 衰退病分子標記柑橘衰退病是一種由線性病毒引起的嚴重病害，其既是植物病毒中基因組最大的病毒，也是編碼RNA 沉默抑制子較多的病毒之一[27]。加強植物檢疫，選用抗病性強的品種作為砧木，加強栽培管理，及時防治蚜蟲等措施都是有效預防衰退病的方法。在選育品種時，利用分子標記輔助育種可以幫助選擇具有良好抗病性的品種。Mestre 等[28]采用BSA 方法對枳的衰退病進行遺傳分析，找到7 個RAPD 標記，并將這些RAPD 連鎖標記轉化成SCAR 標記。Deng 等[29]克隆了柑橘NBS-LRR 類抗病基因，并成功定位到3 個與衰退病連鎖的CAP 標記（18P33a、Pt9a 和Pt8a）。Asins等[30]利用病毒積累的QTL 分析研究CTV 與柑橘的互作效應，從中篩選定位到3 個QTL（CTV-A1、CTV-A3和CTV-A5）及其候選基因；后來，Asins等[31]又找到了4 個與抗CTV 相關的候選基因位點（CTVCh14、CTVCh15、CTVCh17和VIC）。 雖 然柑橘衰退病的分子標記研究還面臨許多挑戰，但隨著分子生物技術的不斷發展和應用，未來的研究有望為柑橘育種提供更多的工具和方法。通過探索和利用分子標記，可以更好地了解和控制柑橘衰退病的遺傳基礎，從而提高品種的抗病性和市場競爭力。

3.3 潰瘍病分子標記柑橘潰瘍病是一種由地毯黃單胞桿菌柑橘致病變種引起的細菌性病害。柑橘潰瘍病的主要癥狀包括植株葉片、果實和枝條上出現褪綠的斑點，隨后這些斑點會擴大并變成黃色的潰瘍狀，最終導致這些部分脫落[32]。在柑橘潰瘍病研究方面，Xiang 等[33]通過類受體激酶的候選抗病基因序列，發現了與柑橘潰瘍病抗性密切相關的分子標記位點。彭祝春等[34]通過構建抗性分離群體進行田間抗性測試，再結合SSR 分子標記技術，篩選并驗證了與柑橘潰瘍病抗性相關的分子標記，得到1 個與柑橘潰瘍病抗性相關的分子標記CCR-110。對于柑橘潰瘍病的分子標記研究，目前還相對較少。然而，已有一些研究表明，可能與某些基因有關，這些基因可能涉及到抗病性、耐病性以及與病毒的互作等方面。總的來說，對于柑橘潰瘍病的分子標記研究目前尚未得到足夠的關注，需要更多研究者共同努力來推動這一領域的發展。隨著分子生物技術的不斷發展和應用，未來的研究有望能夠更深入地了解和應對柑橘潰瘍病的威脅。

4 柑橘抗逆性相關的分子標記

柑橘抗逆性是指柑橘植株在逆境條件下仍然能夠正常生長和繁殖的能力，這種能力受到許多因素的影響，包括柑橘植株的基因型、環境因素、土壤和氣候條件等[35]。在柑橘抗逆性的分子標記研究方面，一些研究者正在致力于尋找與抗逆性相關的分子標記。這些分子標記可能涉及到多個基因和蛋白質，包括與細胞保護、抗氧化、抗炎和免疫反應等相關基因。例如，在柑橘耐冷性狀研究方面，Weber等[36]使用柚和枳雜交F1群體，檢測到3 個與抗低溫相關的QTL；馬喜軍[37]運用電導法進行抗寒力測定，檢測到7 個與抗寒性相關的QTL，分別分布于LW1、LW2、LW3 和LW8 連 鎖 群 上。Hong等[38]在LG1、LG2、LG3 和LG4 上檢測到4 個抗寒性相關的QTL（qFT1.1/2.1/3.1/4.1），可解釋較多的表型變異。Abouzari 等[39]研究發現了與柑橘耐冷能力相關的SSR 和AFLP 分子標記，并且其中的一些分子標記與植株的超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量相關。在柑橘耐鹽性狀研究方面，Kolstad[40]以枳和柚的BC1群體為材料，在鹽和非鹽環境中進行Na+和Cl-積累相關性狀的QTL 分析，發現了73 個潛在數量性狀位點。Raga 等[41]對柑橘砧木Trifoliata 和CleopatraMandarin 的雜交后代進行遺傳研究，通過區間定位和多QTL 定位共檢測到98 個與耐鹽性相關的QTL。在柑橘耐旱性狀研究方面，肖金平等[42]通過cDNA-AFLP 方法篩選到干旱脅迫下柑橘葉片中的差異表達基因TDF；此外，盧婷等[43]研究表明WRKY75基因受多種非生物脅迫誘導表達，推測其可能在柑橘響應非生物脅迫過程中發揮了重要作用。李瀟等[44]研究發現，甜橙CsMYB96能被低溫和干旱脅迫誘導表達。檸檬ClMYB96和金柑FmMYB96在高鹽脅迫下被誘導表達，而蘆柑CrMYB96的表達量在低溫、干旱和高鹽脅迫下都有不同程度的下調表達。

5 結語與展望

在過去的半個多世紀以來，我國的柑橘育種進程逐漸加快，先后經歷了4 個重要的育種時代，即利用自然變異時代（V1.0）、雜交產生變異時代（V2.0）、生物技術育種的細胞水平時代（V3.0）和分子水平時代（V4.0）。從最初的芽變選育時代到分子育種時代，柑橘育種進程呈現快速發展趨勢[3]。然而，由于柑橘類型繁多、形態復雜且易發生芽變，其模糊的遺傳背景在一定程度上阻礙了柑橘類的育種進程。此外，由于實生苗生長速度緩慢，導致育種年限長、育種效率低。

分子標記能夠直接鑒別生物個體間的本質差異，不受時間和空間的限制。但是當前大多數分子標記還停留在實驗室階段，距離實際應用還有較大距離，并且在實際應用中簡單照搬就可以使用的分子標記并不多見。因此需要應用分子標記技術深入研究柑橘的重要性狀，詳細可靠地對其遺傳規律進行分析，并開發與重要性狀緊密連鎖的分子標記利用分子標記輔助基因聚合育種，將控制不同優良性狀的基因聚合，有效縮短選育周期，培育柑橘新種質。

未來的研究將更加關注于尋找與品質和抗病性相關的分子標記。分子標記技術與蛋白組、代謝組等生物技術相結合，更深入地了解品質和抗病的機制。同時，柑橘品種選育要以消費者的需求為目標，新品種創制應朝著優質多元化方向發展。在果實品質提升方面，深入挖掘易剝皮、無籽、有香味、風味濃等相關性狀的分子標記。在滿足柑橘周年化市場供應需求方面，找尋與早、中、晚熟品種相對應的分子標記。還需要積極探索適合機械化栽培的柑橘砧木和接穗品種，如開發矮化、直立樹形和枝條無刺等性狀相關的分子標記。此外，還應利用分子標記輔助育種篩選高抗性柑橘品種，特別是高抗黃龍病的品種或砧木。