基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討千層紙素A治療椎間盤退變的分子機制

劉明陽，趙翔，張宇，張鍇廣，高延征

(河南省人民醫(yī)院脊柱脊髓科，鄭州大學人民醫(yī)院，河南大學人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

椎間盤退變是肌肉骨骼系統(tǒng)的一種高發(fā)疾病，常導致椎管狹窄、椎間關節(jié)不穩(wěn)定、疼痛甚至畸形[1]。其作為椎間盤源性腰痛的重要原因，常常給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[2]。椎間盤退變的發(fā)病機制與髓核細胞凋亡、衰老、炎癥、氧化應激、細胞外基質(zhì)降解以及異常血管形成密切相關[2-4]。目前，椎間盤退變的藥物治療旨在緩解癥狀，而不是阻止或逆轉椎間盤受損的病理進展。千層紙素A是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，其化學全名為5，7-二羥基-6-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮[5]。據(jù)報道，千層紙素A具有廣泛的藥理作用，其中抗炎和抗癌作用最受關注，其他作用包括抗病毒、神經(jīng)保護和抗血管生成作用等[6]。千層紙素A對于包括骨性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎和骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種肌肉骨骼系統(tǒng)的疾病均顯示出良好的治療作用[7-9]。考慮到其顯著的抗炎作用，千層紙素A可能是治療椎間盤退變的潛在選擇。網(wǎng)絡藥理學將分子化合物與藥理學、系統(tǒng)生物學與生物信息學結合起來構建“化合物-靶點-疾病”的網(wǎng)絡預測模型，能夠系統(tǒng)地闡述化合物對于疾病的潛在作用靶點和相關通路[10]。現(xiàn)階段對千層紙素A治療椎間盤退變的作用靶點以及其發(fā)揮作用的分子機制的研究仍然有限。因此，本研究使用網(wǎng)絡藥理學方法，進一步預測千層紙素A治療椎間盤退變的作用靶點和其作用機制，為后續(xù)開展千層紙素A相關的藥理研究及椎間盤退變防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 千層紙素A靶點基因的篩選在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索關鍵字Oroxylin A并下載結構式和SMILES式，然后將結構式導入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，SMILES式導入SwissTarget Prediction(STR)數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity ensemble approach(SEA)數(shù)據(jù)庫(https://sea.bkslab.org/)以獲取藥物作用靶點。STR數(shù)據(jù)庫使用Probability>0為過濾條件篩選數(shù)據(jù)。PharmMapper數(shù)據(jù)庫使用norm fit score≥0.7為過濾條件篩選數(shù)據(jù)，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.Uniprot.org/)將從PharMapper數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)轉換為相應的基因。SEA數(shù)據(jù)庫不設置過濾條件。3個數(shù)據(jù)庫物種選擇均為人類。隨后將3個數(shù)據(jù)庫獲取的基因合并，去除重復的基因，即得到千層紙素A的潛在的藥物作用靶點

1.2 千層紙素A在椎間盤退變中相關靶點的篩選以“Intervertebral disc degeneration”為關鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)中搜索椎間盤退變相關基因靶點。將2個數(shù)據(jù)庫的靶點合并得到椎間盤退變的潛在致病基因。將椎間盤退變相關靶點和千層紙素A的藥物靶點取交集，獲得二者的共同基因即為千層紙素A抗椎間盤退變的潛在關鍵靶點。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡構建PPI網(wǎng)絡的構建對于研究蛋白質(zhì)功能至關重要，它可以更加系統(tǒng)、全面地研究疾病分子機制、發(fā)現(xiàn)新藥靶點等。將千層紙素A對應的椎間盤退變相關基因?qū)朐诰€STRING數(shù)據(jù)庫，將物種設置為“人類(homo sapiens)”，可信度設置為0.4，選擇“hide disconnected nodes in the network”刪除無相互作用的蛋白質(zhì)。下載蛋白質(zhì)互作的tsv文件并將其導入到Cytoscape 3.8.0軟件中，運用Analysis network工具進行網(wǎng)絡分析。度值顯示與單個節(jié)點連接的節(jié)點數(shù)，其可作為反映靶點基因關鍵程度的指標。根據(jù)度值的高低調(diào)整節(jié)點的大小和顏色的深淺。節(jié)點度值越高，則節(jié)點越大，顏色越深。邊的粗細根據(jù)combine_score進行調(diào)整。combine_score值越高，則邊越粗。最后利用R語言的“count R”包處理tsv文件，按照度值排列得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡相關核心基因的條形圖。

1.4 基因本體(Gene Ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析在R語言中導入千層紙素A抗椎間盤退變相關的潛在靶點，用“clusterProfile”包進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析并進行可視化展示，篩選條件設定為P<0.05以及q<0.05。得到千層紙素A抗椎間盤退變的生物學過程(biological process，BP)、分子功能(molecular founction，MF)和細胞組成(cellular component，CC)以及KEGG信號通路信息。通過“ggplot”包繪制氣泡圖，用Cytoscape 3.8.0軟件對靶點-通路進行網(wǎng)絡分析，篩選出度值高的靶點。將靶點-通路網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡中篩選出的度值較高的靶點取交集，得到關鍵基因。

1.5 分子對接分子對接是一種用于預測生成結合模型的兩個分子之間的相互作用的方法，可以估算出小分子配體和生物大分子受體的結合能大小，為藥物設計提供新的思路。將千層紙素A作為配體，關鍵基因編碼的蛋白作為受體。在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載配體的二維結構文件，利用Chem3D軟件進行化合物結構優(yōu)化并保存為mol2格式。從蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫中獲得大分子受體的蛋白結構并用PyMol軟件對受體蛋白進行前處理。使用AutoDock軟件給蛋白質(zhì)分子加氫和加電子并將配體和受體文件轉換為pdbqt格式，對受體活性口袋進行定義并保存為gpf文件。利用AutoDock vina進行分子對接。一般認為自由能在-4～0 kcal·mol-1之間代表結合力較弱，-7～-4 kcal·mol-1之間代表結合力中等；自由能小于-7 kcal·mol-1代表結合力較強[11]。最后通過PyMol軟件對對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 靶點篩選將從STR、SEA、PharmMapper數(shù)據(jù)庫中得到的藥物作用靶點去重后共得到202個靶點基因。然后將GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索到的椎間盤退變相關基因靶點去重得到1 212個致病靶點。利用R語言將千層紙素A的藥物作用靶點與椎間盤退變的致病靶點進行匹配取交集，最終得到35個共同靶點。見圖1。

圖1 千層紙素A與椎間盤退變靶點圖

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡根據(jù)節(jié)點的度值將靶基因分布為2個同心圓，外層靶基因的度值為1～15，內(nèi)層靶基因的度值為16～25，得到千層紙素A與椎間盤退變相關主要靶點PPI網(wǎng)絡圖。經(jīng)R語言的“count R”包得到按核心基因度值排列的條形圖。其中排名靠前的核心靶點有白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)等。見圖2。

A為千層紙素A治療椎間盤退變的蛋白互作網(wǎng)絡；B為度值排名前15的基因。

2.3 GO與KEGG分析GO分析發(fā)現(xiàn)千層紙素A治療椎間盤退變的靶點在生物過程主要包括對炎癥反應的調(diào)節(jié)、對缺氧的反應和細胞對化學應激的反應等。在細胞組成主要富集于染色體區(qū)、線粒體基質(zhì)、樹突棘等。在分子功能主要富集于金屬蛋白酶活性、生長因子受體結合等。見圖3。

圖3 GO功能富集分析

KEGG分析顯示相關信號通路主要涉及雌激素信號通路、PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。見圖4。隨后將千層紙素A抗椎間盤退變的預測靶基因以及根據(jù) KEGG通路的富集分析結果篩選出來的通路導入Cytoscape 3.8.0軟件進行“靶標-通路”分析，展現(xiàn)二者之間的聯(lián)系。見圖5。經(jīng)過與PPI網(wǎng)絡分析得到的關鍵靶基因?qū)φ眨Y選出IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9共4個關鍵靶基因用于后續(xù)的分子對接。

圖4 KEGG功能富集分析

圖5 靶點-通路分析

2.4 分子對接為進一步探索千層紙素A與關鍵靶點之間的相互作用關系，IL-6(PBD ID：1IL6)、VEGFA(PBD ID：1VPF)、EGFR(PBD ID：1XKK)和MMP9(PBD ID：2OVX)被用來與千層紙素A進行分子對接。選取最低結合能的組合，結果表明千層紙素A與IL-6的結合能為-7.2 kcal·mol-1，與VEGFA的結合能為-7.8 kcal·mol-1，與EGFR的結合能為-8.7 kcal·mol-1，與MMP9的結合能為-10.0 kcal·mol-1。分子對接的結果顯示千層紙素A與靶基因均具有良好的結合能力。見圖6。

圖6 分子對接示意圖

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法，探討千層紙素A抗椎間盤退變的潛在分子機制。既往研究顯示，千層紙素A有較強的抗炎和抗血管生成作用[6]。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)千層紙素A可以通過抑制ERK和PI3K/AKT信號通路的激活來減輕IL-1β誘導的關節(jié)軟骨細胞炎癥反應。而另一項研究則證實千層紙素A可以通過抑制NF-κB和Wnt/β-catenin信號通路減輕關節(jié)軟骨細胞的肥大和炎癥反應，從而延緩大鼠模型中骨性關節(jié)炎的進展[12]。Gao等[13]發(fā)現(xiàn)，千層紙素A通過阻斷VEGF誘導的KDR/Flk-1(VEGFR-2)磷酸化和相關下游信號分子(包括p38絲裂原活化蛋白激酶、ERK和Akt)抑制血管生成。有關千層紙素A治療椎間盤退變的研究雖未見報道，但考慮到炎癥與異常的血管生成與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展密切相關[3]，千層紙素A可能是治療椎間盤退變的潛在選擇。

GO富集分析結果顯示生物過程主要包括對炎癥反應的調(diào)節(jié)、對缺氧的反應和對化學應力的反應等。炎癥反應直接參與椎間盤退變的進展，還可導致繼發(fā)性腰痛和神經(jīng)根性癥狀。炎癥反應參與椎間盤退變的各種病理過程，包括細胞外基質(zhì)降解、髓核細胞的凋亡和衰老[2]。椎間盤患者椎間盤組織中促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達顯著增加[14-15]。Kwon等[16]發(fā)現(xiàn)缺氧可以增強炎癥反應環(huán)境下椎間盤的血管生成能力，并通過抑制細胞外基質(zhì)的合成促進椎間盤退變的發(fā)展。KEGG富集分析結果顯示與千層紙素A治療椎間盤退變相關的通路可能包括PI3K/AKT信號通路、雌激素信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。PI3K/AKT信號通路被證明與椎間盤退變的疾病進程密切相關。Jiang等[17]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過激活PI3K/Akt通路抑制IL-1β誘導的髓核細胞凋亡，而雌激素可以通過激活PI3K/Akt通路來減輕炎癥反應，降低氧化應激水平從而抑制髓核細胞的凋亡。TNF和IL-17途徑主要通過促進炎癥因子的釋放、髓核細胞的凋亡和細胞外基質(zhì)的降解在椎間盤退變的進展中發(fā)揮協(xié)同作用[18]。此外，AGE-MG-H1的積累與椎間盤退變過程中的軟骨細胞肥大和成骨分化有關，并且這些與RAGE直接相關，表明AGE-RAGE可能是一個潛在的治療靶點[19]。

PPI網(wǎng)絡分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9是千層紙素A抗椎間盤退變作用關聯(lián)度最高的靶點。分子對接結果表明，千層紙素A與核心靶基因IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9均具有良好的親和力。多項研究顯示IL-6的過表達與椎間盤退變密切相關[20-22]。作為一種重要的炎癥因子，既往研究顯示IL-6可通過PI3K/Akt和Ras通路調(diào)控下游基因的表達從而參與椎間盤退變的進程[20]，與本研究中KEGG富集分析的結果相符。VEGFA屬于VEGF家族，是促進微血管形成的重要細胞因子[23]。羅堅等[24]發(fā)現(xiàn)VEGF可以促進椎間盤組織新生血管的形成和毛細血管的浸潤從而導致椎間盤組織的吸收退變。本研究結果表明千層紙素A可能通過靶向作用于VEGFA從而抑制椎間盤組織異常的血管生成從而減緩椎間盤退變的進展。EGFR屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族，有研究證實EGFR可以通過Src/ERK/STAT3通路誘導髓核細胞的炎癥反應[25]。而千層紙素A則可能通過作用于EGFR從而抑制下游的炎癥反應。MMP9屬于MMP家族，其主要水解底物為變性膠原以及Ⅳ、Ⅴ型膠原[26]。Li等[27]發(fā)現(xiàn)退變的椎間盤組織中MMP-9的水平高于正常水平，且升高的水平與退變程度呈正相關。千層紙素A可通過靶向作用于MMP抑制髓核細胞外基質(zhì)的降解。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法分析千層紙素A與椎間盤退變靶點的相互關系。IL-6、VEGFA、EGFR和MMP9是潛在的關鍵靶點。結合文獻資料，千層紙素A抗椎間盤退變的藥理機制與抑制髓核細胞凋亡、抑制細胞外基質(zhì)降解、抗炎和抗血管生成等相關通路密切相關。由于當前研究是基于數(shù)據(jù)庫的預測分析，研究結果有存在偏差的可能。后續(xù)研究需結合預測的靶點及通路，進一步通過實驗驗證千層紙素A抗椎間盤退變的具體機制。盡管如此，本研究仍為探討千層紙素A對于椎間盤退變治療作用的實驗及臨床研究提供了新方向。