血小板活化因子受體拮抗劑銀杏二萜內酯治療腦梗死的作用機制

陳雪敏，黃燕

(1.廣東醫科大學 第一臨床醫學院，廣東 湛江 524023；2.廣東醫科大學肇慶市第一人民醫院 神經內科，廣東 肇慶 526060)

腦卒中是我國國民致死、致殘的首位病因，其中腦梗死發病率最高(約占71.55%)，故探尋切實有效的腦梗死防治手段十分重要[1]。銀杏二萜內酯(ginkgo diterpene lactone，DGMI)是目前上市的超強效血小板活化因子受體(platelet activating factor receptor，PAFR)拮抗劑，主要包括銀杏內酯A、B、K(ginkgolide A、ginkgolide B、ginkgolide K，GA、GB、GK)的有效成分，可拮抗血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)與受體結合，抑制PAF對腦梗死產生的廣泛的病理效應，對治療腦梗死具有重要意義。本文通過綜述DGMI治療腦梗死的相關作用機制，包括抗血小板聚集、抗炎、抗氧化應激、抗凋亡、減輕血腦屏障的損傷、降低谷氨酸興奮性毒性、促血管生成、促神經元及髓鞘的保護或再生，以期為更好地應用于腦梗死的治療提供參考和指導。

1 抗血小板聚集

目前PAF靶點是血小板聚集通路中已知的最前端靶點，DGMI通過拮抗PAF與受體結合，抑制PAF途徑，也是獨立于花生四烯酸(arachidonic acid，AA)和腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)誘導血小板聚集的第3條途徑，從而達到抗血小板聚集的目的。(1)DGMI的主要活性成分GA、GB、GK 均可通過選擇性結合血小板膜上的PAFR，拮抗PAF與受體結合，從而顯著拮抗PAF途徑誘導的血小板聚集，其中GK對PAFR具有高度的選擇性，拮抗活性最強[2]。(2)環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是PAF誘導的血小板聚集中的重要信號分子，cAMP水平的降低可使腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)依賴的鈣離子通道脫磷酸化，促使[Ca2+]i釋放及[Ca2+]i釋放引起的血小板聚集等一系列級聯反應。在PAF誘導的血小板中，GA、GB、GK可顯著提高cAMP的含量，進而抑制[Ca2+]i釋放及后續的血小板聚集反應[2]。(3)已知cAMP和環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)在靜息和膠原蛋白刺激的血小板中具有抗血小板功能，基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)可劑量依賴性地明顯抑制由膠原蛋白刺激的血小板聚集。GB激活的MMP-9可增加細胞內cAMP和cGMP的產生，且可直接降低與AA途徑相關的環氧合酶1(cyclooxygenase-1，COX-1)或血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)合成酶活性，抑制細胞內Ca2+動員和TXA2的產生，從而抑制血小板聚集[3]，這也為DGMI是否能在腦梗死急性期協同增加AA途徑或ADP途徑抗血小板藥物抑制的血小板聚集作用而創立新型的更加有效的聯合抗血小板方案提供了思路，但目前仍需進一步研究，同時也應警惕其出血風險。

2 抗炎

炎癥反應是腦梗死的重要病理生理機制，其炎癥細胞因子的顯著表達，可觸發包括微血管阻塞、細胞毒性酶釋放和氧自由基產生等多種機制而導致腦組織損傷[4]。PAF是一種有效的促炎脂質介質，與PAFR結合后，PAF可能會激活包括核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)這些重要的細胞內炎癥信號通路[5]，它們可能進一步觸發PAF介導的多種炎癥因子的表達和釋放，例如腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，從而在腦梗死中加重缺血性損傷。DGMI通過與細胞膜上PAFR的活性位點結合來競爭性或非競爭性地抑制PAF活性，抑制PAF介導的炎癥反應，阻止或減少促炎細胞因子的釋放。一項利用大腦中動脈閉塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)和氧-葡萄糖剝奪/再氧合(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型分別模擬體內和體外缺血/再灌注過程的實驗發現，DGMI可能通過Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)/NF-κB通路，抑制TLR4mRNA表達和NF-κB從細胞質到細胞核的轉移，從而抑制了該炎癥信號通路相關的炎癥反應與促炎因子的表達，同時DGMI可減輕原代星形膠質細胞OGD/R損傷和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的炎癥反應，最終顯著減少腦梗死面積和腦水腫，減輕缺血誘導的腦組織損傷，改善神經功能缺損評分[5-6]。Yu等[6]研究表明，對于OGD/R誘導損傷的星形膠質細胞，GK、GB均有抗炎作用，其中GK抗炎作用更為顯著，除了降低炎癥因子TNF-α、IL-6的表達，還可上調抗炎因子IL-10的表達。綜上，雖然有相關研究提示著DGMI的抗炎作用，有望為腦梗死提供新的治療價值，但其潛在的分子機制尚未完全明確，需要更多的研究證據進一步證實。

3 抗氧化應激

氧化應激在腦梗死級聯反應的發生和發展中至關重要，腦缺血期間活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生過多或清除能力降低，引起氧化和抗氧化系統失衡，導致細胞凋亡、組織損傷并可能最終在再灌注后導致神經功能的嚴重缺損甚至腦死亡。研究發現，對于體外OGD/R誘導損傷的SH-SY5Y細胞或體內建立的大鼠MCAO/R模型，GA、GB、GK可通過Akt/Nrf2通路發揮抗氧化作用，三者均可明顯降低ROS的含量，增加氧自由基的天然清除劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性，其中GB對腦梗死的抗氧化應激作用最強，可顯著上調抗氧化應激的相關蛋白HO-1、Nqo1、SOD、p-Akt、p-Nrf2和Nrf2的水平，從而抑制腦缺血再灌注引起的氧化應激損傷[4,7]。目前臨床上一些藥物的抗氧化治療有助于減輕腦缺血損傷，但效果不理想，研究發現DGMI的有效成分GA、GB、GK均具有抗氧化作用，無疑為之帶來了福音，但其具體的抗氧化機制尚未成熟，仍需進一步研究。

4 抗凋亡

急性腦梗死可啟動細胞凋亡諸多關鍵分子事件，如炎癥反應、自由基的過度產生、Ca2+超載和興奮性毒性等，使得神經功能進一步惡化。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種重要的內源性防御分子，可對有害刺激作出反應而抵抗腦缺血性損傷，Cao等[8]的研究首次探索了GB在腦梗死中的線粒體抗凋亡作用，并發現其與依賴于AMPK通路激活的磷酸酶和張力蛋白同源物誘導的激酶1(PTEN-inducedkinase1，PINK1)表達上調有關。其研究發現，在短暫的大腦中動脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，t-MCAO)誘導的大鼠局灶性腦缺血模型中，隨著PINK1表達、AMPK活性增加，GB可明顯減少神經元損失和細胞凋亡，而在OGD/R誘導損傷的SH-SY5Y細胞中，GB通過上調線粒體外膜中PINK1的表達來減少線粒體損傷，進一步防止線粒體的凋亡。GK可抑制OGD誘導的SH-SY5Y細胞中p38和JNK的激活，降低p53和c-Jun的磷酸化，抑制線粒體介導的凋亡途徑，并以劑量依賴性方式增加OGD損傷的SH-SY5Y細胞活力，降低細胞內ROS含量，防止OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。同時，研究表明，GK可降低促凋亡蛋白Bax、胱冬肽酶-3和胱冬肽酶-9的水平，并增加抗凋亡蛋白BCL-2的表達，保護細胞免于凋亡，從而減少腦梗死的面積[9-10]。目前研究發現GB、GK可能是潛在的用于挽救腦梗死誘導的神經元凋亡的化合物，這為腦梗死的有效預防提供了新的方向可能，但目前類似研究報道數量有限，其潛在的分子機制有待進一步探討。同時，值得注意的是，細胞凋亡涉及炎癥反應等諸多分子事件，故推測DGMI可能不僅僅只是通過單一靶點或單途徑發揮抗凋亡作用，DGMI可能通過多條信號通路直接或間接協同發揮抗凋亡作用，而目前這方面的研究尚有欠缺，值得進一步深入研究。

5 減輕血腦屏障的損傷

血腦屏障(blood brainbarrier，BBB)將血液與腦實質分離，有效地介導中樞神經系統的物質交換，其完整的屏障結構抑制了有害物質的流入。BBB損傷是腦梗死的關鍵病理過程，Yang等[10]的研究表明，GB的預處理增強了OGD/R損傷的毛細血管內皮單層的跨內皮電阻，降低了熒光素鈉的內皮通透系數，并增加了緊密連接蛋白 ZO-1在內皮細胞中的表達，從而降低了BBB的通透性，避免了大量有害物質透過BBB進入腦組織中，因而減輕腦組織的損傷。作為一種大分子蛋白，IgG在正常情況下不能通過BBB，只有在BBB破壞時，血漿IgG才可能泄漏到腦組織中。Chen等[11]通過復制tMCAO小鼠模型，提示GK可顯著減少IgG的漏出，表明GK可減輕腦缺血后BBB的損傷。綜上，越來越多的臨床前研究提示了DGMI活性成分的血腦屏障保護作用，應注意的是，DGMI是一種中藥制劑，在治療腦梗死方面的血腦屏障保護是否優于其活性成分需進一步研究，其活性成分是否存在協同作用及對應機制有待探討。

6 降低興奮性氨基酸毒性

谷氨酸(glutamate，Glu)、天冬氨酸(aspartic acid，Asp)是中樞神經系統(central nervous system，CNS)的興奮性神經遞質，二者過度釋放將導致興奮性神經毒性，影響腦梗死缺血再灌注損傷的預后。其中Glu是CNS最豐富的游離氨基酸，在腦梗死誘導下，神經細胞中Glu受體會過度激活，Glu轉運障礙可致細胞外Glu含量增加，進而導致周圍神經元興奮性毒性，刺激細胞死亡，同時Glu可誘導腦水腫，最終損害神經功能。Glu興奮性毒性被認為是缺血性神經元死亡的主要原因，有多項研究因此試圖通過減少Glu以在腦梗死等疾病中達到神經保護作用的目的[12]。研究顯示，MCAO大鼠缺血再灌注24 h后，腦脊液中Glu、Asp 含量明顯增多，但在DGMI及其主要成分作用下，二者的含量可顯著降低，表明DGMI能修復腦內因缺血引起的氨基酸動態平衡失調，有助于改善神經功能缺損，發揮對腦缺血的保護作用[13]。

7 促血管生成

大腦高度依賴血液為大腦神經元提供葡萄糖和氧氣而進行有效的物質交換，新血管的生成可恢復腦缺血區的血供，挽救缺血半暗帶，減小腦梗死的面積，從而改善神經功能，因此促血管生成也是腦梗死治療的重要靶點[14]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的血管生成因子，缺氧誘導因子-1α(hypoxia induicible factor-1α，HIF-1α)是目前已知的唯一VEGF啟動子誘導轉錄因子，缺氧激活的信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)可有效調節HIF-1α的穩定性。在細胞增殖、分化和促血管生成中，Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/STAT3信號通路起著關鍵作用。Chen等[11]的研究證實GK可通過JAK2/STAT3信號通路顯著上調STAT3的表達，進而上調HIF-1α和VEGF的表達，從而發揮促血管生成的作用，研究結果也提示GK可能與VEGF協同發揮潛在作用，從而保護腦血管免于滲漏、出血。該研究發現，GK增強了tMCAO小鼠的局部小腦血流量，進一步支持了GK的促血管生成作用，研究同時證實了GK可通過VEGF以JAK2/STAT3依賴的方式保護內皮細胞免受OGD/R的損傷。

8 促神經元、髓鞘的保護或再生

腦缺血后大腦內源性神經干細胞(neural stem cell，NSC)被誘導增加，產生的新神經元向受損腦區遷移、分化為成熟的神經元，從而部分補充受損或丟失的神經元，促進神經網絡的再生，但自發缺血誘導的NSC的增殖不足以滿足CNS自我修復的需求，通過外源性藥物促神經元再生有望成為腦梗死的新療法。Zheng等[15]研究發現，在MCAO模型大鼠中，GB可增加神經元標志物，包括巢蛋白、神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性細胞的比率，增加腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的mRNA表達，從而促進NSC的增殖、遷移和分化，改善缺血所致的神經功能受損。已知細胞周期退出是神經元分化之前的關鍵步驟，Wnt途徑對于積極調節神經發生、神經突生長和神經元存活有重要作用，Li等[16]研究表明GB可以促進新生小鼠側腦室下區(subventricular zone，SVZ)衍生的NSC中細胞周期的退出和神經元分化。此外，該研究發現GB通過增加Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路中β-catenin的核水平，進而激活經典的Wnt通路而促進神經元的增殖和分化。腦梗死的白質缺血性損傷通常伴有少突膠質細胞(oligodendrocyte，OL)的凋亡和脫髓鞘，其中星形膠質細胞可能通過分泌BDNF和睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)來支持OL前體細胞(oligodendrocyte precursor cell，OPC)的成熟，促進OL的再生，并增殖、遷移和分化為髓鞘。銅宗(cuprizone，CPZ)是一種銅離子螯合劑，可誘導OL死亡并引發脫髓鞘，Wang等[17]研究表明，GB和GK可促進CPZ喂養小鼠的OL再生，通過促進OPC增殖和抑制Wnt信號傳導防止胼胝體區域的脫髓鞘。血小板聚集引起的血栓堆積可能導致星形膠質細胞的活化和炎性細胞因子的釋放，而這些細胞因子的擴散是OL細胞凋亡和脫髓鞘的主要原因，該研究也表明GB和GK可拮抗星形膠質細胞中PAFR的表達，抑制細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，拮抗PAF誘導的炎癥反應，增加BDNF和CNTF的表達，支持髓鞘再生，這些發現對于修復神經功能、防止腦梗死進展加重具有重要意義。DGMI對腦梗死的促神經、髓鞘再生潛在作用及價值使其成為近年新的研究熱點，目前這方面研究數據較少，說服力遠遠不足，需更多的研究進一步論證，以期為腦梗死的更好治療帶來新的希望。

9 總結與展望

DGMI是強效的血小板活化因子受體拮抗劑，不同于以往腦梗死大部分治療藥物僅存在相對單一的作用機制，DGMI可作用于腦梗死多個病理環節，具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化應激、抗凋亡、減輕血腦屏障的損傷、降低谷氨酸興奮性毒性、促血管生成、促神經元及髓鞘的保護或再生多種作用，可更全面有效地防治腦梗死，有望降低腦梗死的致殘率、病死率及復發率。本文綜述了其相關作用機制，旨在為更好地應用于腦梗死提供參考。值得注意的是，目前大多數研究主要涉及DGMI主要成分GA、GB、GK單成分的研究，有關DGMI整體的基礎研究相對較少，不能排除整體、個體效應的影響，同時，DGMI是一種中藥制劑，大部分相關機制臨床前研究尚不夠成熟、未能完全明確，尚需更多的研究支持，其中的促神經、髓鞘保護或再生作用具有極大的潛在研究價值，值得深入研究和探索。另外，目前DGMI作用機制研究多集中在單一靶點或信號通路上，忽略了不同機制多個信號通路間可能存在的協同效應，未來可進一步探究DGMI多種作用機制間的相互影響，期待進一步的探索能有助于其未來更好地應用于腦梗死的防治。