miR-30a-5p調控ECM-受體作用信號通路相關蛋白抑制肺腺癌細胞的侵襲和遷移

夏建洪 周立慶 嚴研 馬婷婷 蘇欣宇

肺腺癌是最常見的肺癌類型。盡管學者在肺腺癌的診斷和治療策略上已經取得了進展，但肺腺癌的死亡率依然很高。因此，闡明肺腺癌發生、發展的分子機制，尋找早期檢測的新方法和新的分子治療靶點非常必要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小的、高度保守的非編碼RNA分子，是一種有前途的生物標志物，可用于早期癌癥的檢測和準確的預后，并可作為癌癥治療的靶點[1-2]。miRNA的表達水平與肺腺癌細胞的生物學功能息息相關[3-4]。miR-30家族包括 miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e，這些基因在不同腫瘤中也起著重要的作用[5-7]。作為miR-30家族的一員，miR-30a-5p也被大家廣泛研究。盡管miR-30a-5p已經被發現其可以調控乳腺癌[8]、膽囊癌[9]、肝癌[10]、腎細胞癌[11]和口腔癌[12]等腫瘤細胞的發生、發展，但其在肺腺癌細胞中的功能和機制還鮮有研究。本研究通過生物信息學分析、分子實驗和細胞功能實驗探究miR-30a-5p與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）-受體作用信號通路相關蛋白對肺腺癌細胞增殖和侵襲的調節作用，為尋找肺腺癌新的靶向治療方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 肺腺癌細胞系SPC-A1（批號：BNCC100120）、Calu-3（批號：BNCC338514）、HCC827（批號：BNCC342007）、PC14（批號：BNCC341851）以及人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B（批號：BNCC338205）均購自中國北納生物科技公司。miR-30a-5p模擬物及其陰性對照（批號：miR10000087-1-5）、miR-30a-5p抑制劑及其陰性對照（批號：miR20000087-1-5）均購自中國銳博生物公司；Trizol試劑（批號：10296010）、PBS（批號：10010072）、免疫沉淀分析裂解緩沖液（批號：FNN0011），BCA試劑盒（批號：23227）、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（批號：B1000B）均購自美國 Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒M-MLV reverse transcriptase（批號：18057018）、Lipofectamine 2000試劑（批號：11668019）均購自美國Invitrogen公司；7500 real-time PCR system（批號：4351107）購自德國Applied Biosystems公司；含10%FBS的DMEM培養基（批號：PM150210B）購自武漢普諾賽賽生命科技有限公司；TBST溶液（批號：28360）購自中國Solarbio公司；二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000，批號：ab205718）、一抗為兔抗纖維連接蛋白（Fibronectin）（1∶1 000，批號：ab32419）、兔抗磷酸化纖維連接蛋白（p-Fibronectin）（1∶1 000，批號：ab3349826）、兔抗 E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）（1∶500，批號：ab15148）、兔抗磷酸化E-鈣黏蛋白（p-ECadherin）（1∶5 000，批號：ab226779），兔抗 β-actin（1∶200，批號：ab115777）均購自英國Abcam公司；EC試劑盒（批號：P0018S）購自中國碧云天生物技術公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號：D5879-100 ml）購自美國Sigma公司；分光光度計（型號：N50 Touch）購自德國Implen公司；ECM-受體作用信號通路通道相關蛋白抑制劑（ML327，HY-103038）購自美國Medchemexpress公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將4種肺腺癌細胞及上皮BEAS-2B細胞放在含10%FBS的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染及分組 將Calu-3細胞接種于24孔板（1×105個細胞/孔）中，當細胞融合率達到70%～80%時，根據產品說明書使用Lipofectamine 2000 Reagent將miR-30a-5p模擬物及其陰性對照（設為miR-30a-5p模擬物組、模擬物對照組）、miR-30a-5p抑制劑及其陰性對照（設為miR-30a-5p抑制劑組、抑制劑對照組）轉染到細胞內，隨后，將細胞放置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，轉染后48 h收集細胞行進一步分析。在miR-30a-5p抑制劑組的細胞中加入ECM-受體相互作用通路相關蛋白抑制劑，設為miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組。

1.2.3 miR-30a-5p的mRNA水平檢測 采用qRTPCR法。使用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，并使用反轉錄試劑盒將miRNA轉化為cDNA。然后使用7500 real-time PCR system進行qRT-PCR。以U6為miR-30a-5p的標準化內參，miR-30a-5p上游引物：5'-TACGGATCCCCTTCATCTTACTTTTTTCCCCCAA-3'，下游引物：5'-ATCGCTAGCGAAACTAGAAGCTCGGTGATGAATA-3'；U6 上 游 引 物 ：5'-GGTCGGGCAGGAAAGAGGGC-3'；下游引物：5'-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCC-3'。采用 2-ΔΔCt法計算不同處理組細胞中miR-30a-5p相對表達量。

1.2.4 ECM-受體作用信號通路相關蛋白（Fibronectin和E-cadherin）的表達水平及磷酸化水平檢測 采用Western blot法。將細胞用冷PBS洗滌3次，加入免疫沉淀分析裂解緩沖液后在冰上裂解10 min，采用BCA試劑盒測定蛋白水平。4℃12 000 r/min離心20 min，提取蛋白。將蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的PBS孵育過夜，加入一抗，4℃孵育過夜，一抗孵育結束后，用TBST溶液室溫下搖床搖動洗膜3次，5 min/次。結束后加入二抗山羊抗兔IgG進行孵育，同樣用TBST溶液洗膜3次，5 min/次。用ECL試劑盒拍照觀察蛋白印記，實驗重復3次。

1.2.5 細胞增殖能力檢測 采用噻唑藍[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]實驗。將上述1.2.2部分轉染的肺腺癌細胞Calu-3以每孔4 000個細胞的密度接種于96孔板中。分別培養0、24、48、72 h后，每孔中添加20 μl MTT溶液（0.5 mg/ml），在37℃下孵育4 h，丟棄上層液，加入200 μl DMSO溶解細胞。在490 nm波長處用分光光度計測量吸光度值。

1.2.6 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕愈合實驗。將細胞培養于6孔板中，密度為每孔2×105個。當細胞達到80%的融合度時，用100 μl無菌移液管輕輕刮擦穿過孔中心的單層。細胞用PBS洗滌后，在含有2%FBS的DMEM中孵育24 h，用顯微鏡觀察細胞遷移情況并拍照。

1.2.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。Transwell過濾器的上表面涂有Matrigel。取上述1.2.2部分轉染后的肺腺癌細胞Calu-3進行細胞培養，當細胞處于對數生長期（即融合度達到70%-80%時），將細胞添加于Transwell的上室，下室加入200 μl含有10%FBS的DMEM培養基。37℃孵育24 h后，輕輕取出濾膜和培養基，用棉簽刮除過濾器上表面未被侵入的細胞，然后用4%甲醛溶液固定膜下細胞20 min，細胞用0.1%結晶紫染色，在光學顯微鏡下觀察入侵細胞并拍照。

1.2.8 生物信息學方法 通過癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載表達量數據，利用“edgeR包”進行標準化分析，以miR-30a-5p表達量中位數進行分組，利用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟 件（http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）對miR-30a-5p進行通路富集分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌細胞系和人正常支氣管上皮細胞中miR-30a-5p表達水平比較 與人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B比較，肺腺癌細胞系SPC-A1、Calu-3、HCC827、PC14中miR-30a-5p表達水平均下調（均P＜0.05），其中Calu-3細胞系miR-30a-5p表達水平相對較低，故采用Calu-3細胞系進行后續的功能實驗，見圖1。

圖1 肺腺癌細胞系和人正常支氣管上皮細胞中miR-30a-5p表達水平比較

2.2 miR-30a-5p模擬物對Calu-3細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-30a-5p模擬物組Calu-3細胞中miR-30a-5p表達水平高于模擬物對照組（P＜0.05），見圖2A。培養0、24、48和72 h后，miR-30a-5p模擬物組Calu-3細胞的增殖能力低于模擬物對照組（均P＜0.05），見圖2B。miR-30a-5p模擬物組Calu-3細胞的遷移能力低于模擬物對照組（P＜0.05），見圖2C。miR-30a-5p模擬物組Calu-3細胞的侵襲能力也低于模擬物對照組（P＜0.05），見圖2D。這些結果顯示上調miR-30a-5p可以抑制肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

圖2 miR-30a-5p 模擬物對Calu-3 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（A：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物對照組Calu-3 細胞中miR-30a-5p 的表達水平比較；B：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物對照組Calu-3 細胞的增殖水平比較；C：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物 對照組Calu-3 細胞的遷移變化比較，×40；D：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物對照組Calu-3 細胞的侵襲能力比較，0.1%結晶紫染 色，×100）

2.3 miR-30a-5p通過調控ECM-受體作用信號通路相關蛋白抑制Calu-3細胞的侵襲和遷移 GSEA通路富集分析結果顯示，在Calu-3細胞中，miR-30a-5p顯著富集在ECM-受體作用信號通路上，見圖3A。與抑制劑對照組相比，miR-30a-5p抑制劑組中Fibronectin和E-cadherin的磷酸化水平均上調（均P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Fibronectin和E-cadherin的磷酸化水平得到恢復，見圖3B。與抑制劑對照組相比，miR-30a-5p抑制劑組Calu-3細胞的增殖能力提高（P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Calu-3細胞的增殖能力得到恢復，見圖3C。還發現，與抑制劑對照組相比，miR-30a-5p抑制劑組Calu-3細胞的遷移能力上調（P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Calu-3細胞的遷移能力得到恢復，見圖3D。同樣，與抑制劑對照組相比，miR-30a-5p抑制劑組Calu-3細胞的侵襲能力上調（P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Calu-3細胞的侵襲能力得到恢復，見圖3E。這些結果表明miR-30a-5p是通過調控ECM-受體作用信號通路相關蛋白的磷酸化水平抑制肺Calu-3細胞的增殖、遷移和侵襲。

圖3 miR-30a-5p通過調控ECM-受體作用信號通路相關蛋白抑制Calu-3細胞的增殖、遷移和侵襲（A：miR-30a-5p的GSEA富集通路；B：各處理組細胞ECM-受體作用信號通路相關蛋白磷酸化水平及蛋白表達水平比較；C：各處理細胞組處理后的增殖水平比較；D：各處理組細胞處理后的遷移能力比較，×40；E：各處理組細胞處理后的侵襲能力比較，0.1%結晶紫染色，×100）

3 討論

肺腺癌是最常見的肺癌類型，嚴重危害著人類的生存。雖然肺腺癌的治療已經取得了相當大的進展，包括手術切除、化療、放療或這些方法的結合，但患者的5年生存率仍然處于較低水平[13]。研究證明，miRNA作為致癌或抑癌基因調控腫瘤細胞的生物學功能，包括細胞分化、侵襲、增殖、凋亡等功能[14-15]。作為miR-30a家族中的一員，miR-30a-5p已經被證實與腫瘤的生長有著必要的關系[16-18]。本研究證實miR-30a-5p在肺腺癌細胞中低表達，而后的功能實驗也證明了在肺腺癌細胞中過表達miR-30a-5p明顯抑制了細胞的增殖、遷移和侵襲，因此miR-30a-5p在肺腺癌細胞中很可能是一個抑癌因子，這與先前許多的研究相一致。例如，miR-30a-5p能夠通過阻斷F-盒蛋白45（F-box protein 45，FBXO45）的表達抑制肺鱗狀細胞癌增殖[19]；還能夠通過靶向核苷酸 2（nucleobindin 2，NUCB2）來抑制鼻咽癌的進展[20]。

ECM-受體相作用信號通路是細胞內重要信號轉導通路之一，其在腫瘤的脫落、黏附、降解、運動和增生過程中都起著重要的作用[21]。Yan等[22]發現ECM參與了胃癌腫瘤細胞的侵襲過程。姜黃素能夠通過抑制致癌轉錄因子 AP-2 α（transcription factor AP-2 alpha，TFAP2A）介導的ECM途徑抑制LGR5（+）結腸直腸癌細胞的增殖[23]。同樣的，本研究對miR-30a-5p的GSEA通路富集結果顯示miR-30a-5p明顯富集在ECM-受體作用信號通路上。因此，本研究通過Western blot法檢測了ECM-受體作用信號通路相關蛋白磷酸化水平，實驗證明在肺腺癌細胞中下調miR-30a-5p顯著促進了ECM-受體作用信號通路相關蛋白的磷酸化水平。最后的功能實驗發現miR-30a-5p通過調控ECM-受體作用信號通路促進肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明miR-30a-5p在肺腺癌細胞中顯著下調，miR-30a-5p對肺腺癌細胞有負調節作用，過表達miR-30a-5p能抑制肺腺癌細胞的生物學功能。而且miR-30a-5p對肺腺癌細胞的影響有部分是通過調控ECM-受體作用信號通路相關蛋白達到的。本研究結果有助于深入了解miR-30a-5p在肺腺癌中的作用，miR-30a-5p也有望成為肺腺癌早期診斷和臨床治療的分子靶向。