設施根結線蟲發病與未病土壤真菌多樣性比較

秦立金，劉銘，李艷麗，劉凱炎，陳凡凡，祝海穎，陸鳴，龐文敏，張志潔，劉海婷

（1.赤峰學院 農學院；2.赤峰市農牧業綜合檢驗檢測中心；3.赤峰學院 化學與生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

1 引言

番茄屬于茄科番茄屬，又名西紅柿、番柿、洋柿子等，在國外有“金蘋果”“愛情果”等美譽[1]。由于管理等問題，導致番茄根結線蟲病害日益嚴重。根結線蟲（Meloidogyne spp.）是一種在全世界發生和分布的植物內寄生線蟲，寄主種類達到3000多種，嚴重威脅著世界農業的安全生產[2]在我國，根結線蟲發生范圍廣，發病率高，防治困難，已成為嚴重阻礙我國農業生產的一大病害，每年因根結線蟲造成經濟損失巨大[3]。根結線蟲病是危害番茄的主要土傳病害之一，并且根結線蟲的入侵會使植物根系形成根結，其他病害更容易侵染，嚴重影響番茄的品質。土壤中存在各種各樣的微生物群體，它們對土壤有機質分解、養分循環、土壤結構、植物生長發育以及整個生態平衡都具有重要作用[4]。真菌是有機物質分解和土壤生物量的主要組成部分,在農業生態系統中起著重要的作用[5]。

有關土壤真菌多樣性的研究已見報到，李天來[6]發現番茄連作后改變了土壤真菌種群平衡，這可能是導致番茄產生連作障礙的重要原因之一。王澎[7]等人發現施用有機氮(Gly)肥在一定程度上可以提高真菌的多樣性，提高抗病原菌數量。以上研究在一定程度上都表明了發病與真菌多樣性有關。

本試驗擬測定設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤的真菌多樣性指標，分析其在界、門、綱、目、科、屬水平的多樣性變化，找出發病與未發病土壤的真菌多樣性差異，為以后根結線蟲病的有效防控提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

設施番茄發病、未發病棚室土壤采自內蒙古赤峰市翁牛特旗楊營子設施番茄棚室。

2.2 實驗設計

上茬番茄拉秧時，對設施番茄發病與未發病棚室進行土壤取樣，每個棚室采集土壤3份；采樣時間為上茬番茄拉秧時，同時，調查根結線蟲發病率及病情指數；采集回的土樣及時處理，過1mm篩，標記，-80攝氏度冰箱冷凍，待送檢；對測得的ITS真菌多樣性數據進行顯著性檢驗和分析。

2.3 ITS測序實驗流程

將田間采集的土壤樣品利用OMEGA的試劑盒提取土壤DNA。對提取到的基因組DNA進行瓊脂糖電泳檢測，查看基因組DNA的完整度與濃度。利用Qubit2.0DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。ITS測序使用的文庫構建步驟遵循Illumina測序儀文庫構建方法。從基因組DNA樣品開始，整個ITS測序具體步驟如下：本次測序以ITS2為目標區域進行引物設計，引物序列為fITS7GTGARTCATCGAATCTTTG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC。使用DNA模板50ng，25uL的PCR體系，使用Phusion酶擴增25～35個循環。一輪PCR擴增反應之后，在正反向引物兩端分別加上不同的barcodes，再進行下一輪擴增。擴增完成的PCR產物使用beads純化之后進行上機測序。PCR產物用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer做歸一化處理。構建好的文庫上樣到cBot或簇生成系統，利用Illumina MiSeq測序儀進行2x300bp paired-end測序。對于MiSeq測序獲得的雙端數據，首先根據barcode信息進行樣品區分，然后根據overlap關系進行merge拼接成tag，接著對拼接完成的數據進行數據過濾，隨后進行Q20、Q30等質控分析。對最終獲得clean數據進行OTU聚類分析和物種分類學分析。

2.4 實驗數據

采用IBM SPSS26.0對數據進行平均數±標準差計算和成對數據t檢驗。

3 結果和分析

3.1 界水平差異

設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤真菌界水平絕對和相對豐度差異比較見表1和表2，發病土壤的Fungi/真菌界與未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚土壤/CK2未達到差異顯著（P＞0.05），未發病老棚/CK1分別比發病/Ne和未發病新棚/CK2提高了9.62%和25.00%。

表1 根結線蟲發病與未發病土壤真菌界水平絕對豐度差異比較

表2 根結線蟲發病與未發病土壤真菌界水平相對對豐度差異比較

3.2 門水平差異比較

設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤真菌門水平絕對和相對豐度差異比較見表3和表4，發病土壤的/NeAscomycota/子囊菌門和Unspecified_Fungi/未指明真菌與未發病老棚/CK1和未發病新棚/CK2未達到差異顯著(P＞0.05)，Ascomycota/子囊菌門和Unspecified_Fungi/未指明真菌在未發病老棚/CK1相對豐度分別可達78.24%和3.56%（見表4），而在未發病新棚/CK2相對豐度分別為94.94%和3.35%。發病土壤/Ne的Basidiomycota/擔子菌門與未發病老棚/CK1和未發病新棚/CK2未達到差異顯著(P＞0.05)，但未發病老棚/CK1和未發病新棚/CK2達到差異顯著(P＜0.05)，相對豐度為18.19%和2.16%，未發病老棚土壤/CK1是未發病新棚土壤/CK2的9.69倍。

表3 根結線蟲發病與未發病土壤真菌門水平絕對含量差異比較

表4 根結線蟲發病與未發病土壤真菌門水平相對含量差異

3.3 綱水平差異比較

設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤真菌綱水平絕對和相對豐度差異比較見表5和表6，發病土 壤/Ne的Leotiomycetes/錘 舌 菌 綱 和Agaricomycetes/傘菌綱與未發病老棚土壤/CK1和未發病新棚土壤/CK2未達到0.05差異顯著（p＞0.05），但未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚土壤/CK2差異顯著（p＜0.05），未發病老棚土壤/CK1分別是未發病新棚土壤/CK2的5.32倍和10.04倍（見表5），其中，Leotiomycetes/錘舌菌綱和Agaricomycetes/傘菌綱在未發病老棚土壤/CK1相對豐度可達35.57%和18.05%，而在未發病新棚土壤/CK2的相對豐度分別為8.40%和2.06%（見表6）；發病土壤的Dothideomycetes/座囊菌綱與未發病老棚土壤/CK1未達到差異顯著（p＞0.05），但與未發病新棚土壤/CK2差異顯著，（p＜0.05），是未發病新棚土壤/CK2的17.84倍（見表5），其中，在發病土壤/Ne和未發病新棚土壤/CK2的相對豐度分別為3.62%和3.35%（見表6）；發病土壤的Lecanoromycetes/茶漬綱、Sord ariomycetes/子囊菌綱和Unspecified_Fungi（未指明）與未發病土壤未達到差異顯著（p＞0.05）（見表5），其中，Unspecified_Fungi/未指明絕對和相對豐度占據較大比例，在3種土壤中，相對豐度分別可達74.09%、44.22%和89.41%。

表5 根結線蟲發病與未發病土壤真菌綱水平絕對豐度差異比較

表6 根結線蟲發病與未發病土壤真菌綱水平相對豐度差異比較

3.4 目水平差異比較

設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤真菌目水平絕對和相對豐度差異見表7和表8，發病土壤/Ne的Agaricales/傘 菌 目、Cantharellales/雞 油 菌 目、Helotiales/柔 膜 菌 目、Rhytismatales/斑 痣 盤 菌 目、Hypocreales/肉 座 菌 目、Ostropales/厚 頂 盤 目、Hymenochaetales/銹革孔菌目、Sebacinales/蠟殼耳目和Unspecified_Fungi/未指明真菌與未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚/CK2均未達到差異顯著(P＞0.05)。發病土壤Pleosporales/腔菌目與未發病老棚土壤/CK1未達到差異顯著(P＞0.05)，但與未發病新棚土壤/CK2達到差異顯著（P＜0.05），是未發病新棚土壤/CK2的17.84倍，相對豐度分別為1.84%和0.12%。

表7 根結線蟲發病與未發病土壤真菌目水平絕對豐度差異比較

表8 根結線蟲發病與未發病土壤真菌目水平相對豐度差異比較

3.5 科水平差異比較

設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤真菌科水平絕對和相對豐度差異比較見表9和表10，發病土壤/Ne的Marasmiaceae/小皮傘科、Ceratobasidiaceae/角 擔 菌 科、Agaricaceae/傘 菌 科、Rhytismataceae/斑 痣 盤 菌 科、Hypocreaceae/肉 座 菌 科、Stictidaceae/肉 星 裂 菌 科、Helotiaceae/柔 膜 菌 科、Hymenochaetaceae/刺革菌科、Sebacinaceae/蠟殼耳科、Pleosporaceae/孢 菌 科、Amanitaceae/鵝 膏 科 和Unspecified_Fungi/未分類真菌與未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)。發病土壤/Ne的Psathyrellaceae/水蕨科與未發病新棚土壤/CK2達到差異顯著（P＜0.05），是未發病新棚土壤/CK2的9.13倍，相對豐度分別為1.12%和0.02%。發病土壤/Ne的Inocybaceae/絲蓋傘科與未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)，但未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚/CK2差異顯著（P＜0.05），未發病老棚土壤/CK1是未發病新棚/CK2的4.81倍，在未發病老棚/CK1與未發病新棚/CK2的相對豐度分別可達0.04%和0.01%。

表9 根結線蟲發病與未發病土壤真菌科水平絕對豐度差異比較

表10 根結線蟲發病與未發病土壤真菌科水平相對豐度差異比較

3.6 屬水平差異比較

設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤真菌屬水平絕對和相對豐度差異見表11和表12，發病土壤/Ne的Agaricus/傘 草 屬、Lophodermium/散 斑 殼屬、Trichoderma/木 霉 屬、Hymenochaete/刺 革 菌 屬、Sebacina/蠟殼菌屬和Unspecified_Fungi/未分類真菌與未發病老棚土壤/CK1和未發病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)。未發病土壤/Ne的Coprinellus/鬼傘屬與未發病老棚土壤/CK1未達到0.05差異顯著(P＞0.05)，與未發病新棚土壤/CK2達到顯著差異(P＜0.05)，是未發病新棚土壤/CK2的9.13倍，相對豐度分別為0.12%和0.02%。發病土壤/Ne的Inocybe/絲蓋傘屬與未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)，但未發病老棚土壤/CK1與未發病新棚/CK2差異顯著（P＜0.05），未發病老棚土壤/CK1是未發病新棚/CK2的4.81倍，在未發病老棚/CK1與未發病新棚/CK2的相對豐度分別可達0.03%和0.01%。

表11 根結線蟲發病與未發病土壤真菌屬水平絕對豐度差異比較

表12 根結線蟲發病與未發病土壤真菌屬水平相對豐度差異比較

4 討論與結論

根結線蟲(Meloidogyne spp.)是一種高度專化型的植物病原線蟲，主要危害植物的根部，造成植株產量降低，甚至死亡。南方根結線蟲(M.incognita)寄主范圍廣，在國內分布最廣，危害最大，可加重土傳性真菌危害和大部分細菌病害的發生，嚴重威脅全世界西甜瓜、蔬菜、糧食作物等作物的生長[10-14]，使我國各種作物年平均產量損失達10-15%[15]。

張仁軍[8]等人分析了煙田根際根結線蟲病土與周邊健康土壤微生物群落，通過對比分析發現健康煙田與根結線蟲發病煙田根際土壤真菌微生物群落在門和屬水平上組成相似，但物種豐度存在差異，其中，擔子菌門(Basidiomycota)在健康煙田中占優勢，子囊菌門(Ascomycoda)。在發病煙田中占優勢。本實驗結果表明，Ascomycota/子囊菌門在根結線蟲發病與健康土壤中差異不顯著，本研究結果與前人[8]研究結果存在不一樣的地方，分析原因可能是因為取土地點和發病作物不同導致的，本實驗取土的地點為內蒙古赤峰市設施番茄棚室土樣，而張仁軍等人取土土樣為云南省煙草根際土壤。

本研究結果表明，發病土壤的Basidiomycota/擔子菌門與未發病老棚和未發病新棚未達到差異顯著，但未發病老棚和未發病新棚達到差異顯著，且未發病老棚是未發病新棚的9.69倍，Basidiomycota/擔子菌門為未發病土壤的優勢菌群，此結果與前人[8]一致。陳波[9]等人對香蕉枯萎病區土壤真菌多樣性進行了分析，發病同一地區蕉園中的發病蕉園土壤真菌群落多樣性比健康土壤豐富，但未進行界、門、綱、目、科、屬水平的具體分析。

本研究結果表明，設施番茄根結線蟲發病與未發病土壤，未發病老棚和新棚土壤的真菌群落多樣性不同，未發病老棚Ascomycota/子囊菌門、Leo-tiomycetes/錘舌菌綱、Agaricomycetes/傘菌綱、Inocybaceae/絲蓋傘科、Inocybe/絲蓋傘屬顯著高于未發病新棚，發病土壤與未發病老棚的Pleosporales/腔菌目顯著高于未發病新棚，發病土壤Psathyrellaceae/水蕨科、Coprinellus/鬼傘屬顯著高于未發病新棚。綜上所述，內蒙古赤峰地區設施番茄根結線蟲發病土壤和未發病老棚土壤的真菌多樣性高于未發病新棚土壤。