基于超高效液相色譜－串聯高分辨質譜的血清代謝組學用于探索區分結直腸腺瘤和結直腸癌的生物標志物

楊珊伊，陳鴻煒，周海琳，朱一帆，張嘉豪，王旋成，黃宗聲，張淇淞，2*

（1.廣西大學 醫學院，廣西 南寧 530004；2.湖北民族大學 風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；3.廣西壯族自治區人民醫院消化內科，廣西 南寧 530021）

據世界衛生組織統計，結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是世界3種最常見的惡性腫瘤之一［1］。雖然腫瘤的治療技術在不斷發展，但CRC致死數仍占癌癥死亡總數的9.40%，是腫瘤致死的第二大原因。研究報道，CRC主要通過腺瘤－癌途徑發展而來，結直腸腺瘤（Colorectal adenoma，CA）是CRC的重要癌前病變，通常CA形成CRC完成整個癌變過程約需要10 ~ 15年時間［2－3］，該階段無特異性臨床癥狀，隱匿性較強，一旦發展為CRC，患者的治愈率和生存率將大大降低。患者若能在CA階段獲得及時診斷和治療可明顯改善其生存率和治愈率，因此，CRC的早期篩查對于其預防與診療至關重要［4］。

由于CA發展的隱匿性，其通常難以被發現從而導致診斷延遲或漏診等問題，最終導致CRC的治療和預后效果不理想［5］。目前，傳統的結直腸鏡檢查是診斷CRC的金標準。然而，結直腸鏡檢查屬于侵入性檢查，易導致患者的耐受性差，以及穿孔和出血等并發癥的發生［6］。其他非侵入性方法，如無創定量糞便免疫化學檢測可用于CRC早期無創篩查［7］，但敏感性和特異性不佳。因此，急需尋找一種安全、微創且高效的生物標志物用于CRC的早期診斷和篩查。

相較傳統的結直腸鏡檢查，基于微創或非侵入性生物標志物的診斷檢測具有明顯優勢［8－9］。其中高通量組學技術（代謝組學與脂質組學技術等）被視為疾病診斷和預后生物標志物發現的重要前沿技術［10］。代謝組學技術可以檢測到生物代謝途徑的細微差別，有助于進一步揭示機體生理或病理變化的潛在機制。盡管代謝組學技術已被廣泛應用于多個研究領域，包括癌癥等多種疾病的診療研究［11］，但其在CA和CRC患者判別生物標志物的相關研究尚無報道。研究表明，系統性生物流體中代謝譜的變化主要反映宿主對炎癥或腫瘤等病理變化的反應［12］，其中血清代謝物水平的變化可直接反映機體內源性代謝變化和病理改變，同時激活的免疫反應會影響血液中代謝物的種類或豐度，從而有助于及早發現機體的代謝失調和病變。目前，通過代謝組學技術發現的診斷標志物包括甘油三酯、磷脂酰甘油、5-羥色胺等，對于CRC的臨床診療評估有重要作用［13］。但是目前尚缺乏可用于CRC早期診斷的微創生物標志物，因此，臨床上迫切需要發現新的生物標志物來輔助CRC的早期診斷和預防，以降低CRC的發病率與死亡率。

本研究利用高靈敏度和高分辨率的超高效液相色譜－串聯高分辨質譜（UHPLC－HRMS）技術對CA及CRC患者進行血清非靶向代謝組學研究，通過對比發現CA與CRC患者的血清代謝輪廓差異，結合多元統計分析進行差異代謝物的篩選和評價，進而獲得對CA和CRC患者具有良好判別效能的生物標志物，以輔助CRC的早期診斷，從而針對性地延緩或阻止CA的癌變過程。同時，基于富集和通路分析的主要紊亂代謝通路的發現也為揭示CA惡性轉化的潛在代謝機制提供了支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UHPLC－HRMS儀（美國賽默飛世爾科技公司）；高速冷凍離心機（德國艾本德公司）；密理博超純水系統（美國密理博公司）；渦旋器（上海精科儀器有限公司）；超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）；制冰機（意大利Scotsman公司）；甲醇、二氯甲烷、異丙醇、乙腈、甲酸銨、甲酸均為色譜純（美國默克公司）。

1.2 樣本來源與制備

本研究方案通過廣西壯族自治區人民醫院倫理委員會批準（編號：KY－DZX－202008），收集的所有血清樣本和受試者信息均征求受試者的書面同意，并簽署知情同意書，共納入64例CA患者和84例CRC患者。所有受試者術前禁食8 h，之后將血清樣品收集于凝血管中，以5 000 r/min在4 ℃下離心10 min，將上清液轉移到新的EP管中并于?80 ℃下儲存備用。將預冷的乙腈（200 mL）添加至50 mL血清中，渦旋3 min后在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，吸取全部上清液并進行真空干燥。最后用100μL 75%乙腈水溶液（含0.5 μmol/L D4-脫氧膽酸和他莫昔芬）復溶，渦旋3 min后于4 ℃下以13 000 r/min離心20 min，收集全部上清液用于代謝組學分析。每個樣品取5 μL混合作為質量控制（QC）樣品。在樣品分析前，通過平衡分析系統與至少6份空白樣品和6份QC樣品驗證分析系統和方法的重復性與穩定性［14］。

1.3 液相色譜與質譜條件

液相色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流動相：正離子模式為0.1%甲酸乙腈（A）?0.1%甲酸水（B），負離子模式為0.01%甲酸乙腈（A）?0.01%甲酸水（B）。洗脫程序均為：0.0 ~ 2.0 min，2% A；2.0 ~ 13 min，2% ~ 100% A；13 ~ 18 min，100% A；18 ~ 20 min，100% ~ 2% A。柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL/min；進樣量為5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），輔助氣流速為10 μL/min，鞘氣流速為40 μL/min，離子傳輸管溫度為320 ℃，霧化溫度為400 ℃，噴霧電壓為3.50 kV（正離子）或2.80 kV（負離子）；數據采集模式為Full Scan + ddMS2，一級掃描范圍為m/z100 ~ 1 200，一級和二級質譜的質量分辨率分別為70 000和17 500。

1.4 代謝組學數據處理與分析

將代謝組學原始數據導入數據處理軟件Compound Discovery 3.2中，對數據進行峰對齊和歸一化處理，然后提取獲得含質荷比、保留時間和峰強度的三維數據文件。通過SIMCA－P14.0軟件對代謝組學的三維數據進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS－DA），并采用200次置換檢驗進一步考察分析模型的可靠性和適用性，避免過擬合。由于機體內源性的代謝水平易受到外界因素影響，因此，為減少組間差異代謝物的假陽性率，并根據文獻報道和課題組的前期研究，以變量重要性投影（VIP）> 1.00，倍數變化> 1.50或< 0.67且P< 0.05作為標準篩選組間差異代謝物［14－15］。隨后，根據精確分子量以及離子碎裂信息，利用儀器自帶數據庫（mzCloud及mzValut）和HMDB數據庫對組間差異代謝物進行初步鑒定。最后，利用MetaboAnalyst軟件對差異代謝物進行富集分析和通路分析，通過受試者工作特征曲線（ROC）分析對差異代謝物進行判別效能評價。

2 結果與討論

2.1 主成分分析

將CA組、CRC組和QC組樣本在正、負離子模式下建立PCA模型進行分析，考察儀器系統和檢測方法的穩定性及樣本的分布趨勢。由圖1A和1B可知，QC組樣本在2種ESI模式下的聚集情況良好，說明儀器的穩定性和重現性良好，可滿足代謝組學的分析要求。其中，CA組和CRC組的區分較為明顯，說明兩組的血清代謝譜存在差異。與ESI?模式相比，在ESI+模式下，CA和CRC組的樣本簇之間分離趨勢更明顯。兩組中大部分的樣本點均在95%的置信區間內，只有少數CRC組的樣本點分布在區間外，可能是由于存在較大的個體差異。此外，兩組的部分樣本點存在重疊，說明CA與CRC組間有一定的相似性，兩者的鑒別存在一定難度。

2.2 正交偏最小二乘判別分析

為進一步探究CA組與CRC組之間的代謝輪廓差異，基于PCA分析所涉及的代謝特征進行OPLSDA分析，以篩選組間差異代謝物。與PCA分析的三維得分圖（圖1A、1B）相比，OPLS－DA分析的三維得分圖（圖1C、1D）中CA與CRC組的組間區分更顯著，能更直觀地表明兩者血清代謝譜的差異。在OPLS－DA模型中，正離子模式下的R2X、R2Y、Q2值分別為0.358、0.935、0.760，負離子模式下分別為0.192、0.973、0.767，說明該模型表現出良好的數據解釋和預測能力。隨后，采用200次置換檢驗進一步考察該模型的可靠性與合理性。如圖1E和1F所示，正離子模式下的置換檢驗主要評價參數R2Y、Q2、P值分別為0.944、?0.261和0.000，負離子模式下分別為0.685、?0.358和0.000，且兩者的直線初始點均高于樣品點，提示該模型不存在過擬合，數據分析合理。

圖1 CA與CRC組血清代謝組學的多元統計分析Fig.1 Multivariate statistical analysis for the serum metabolomics of CA and CRC patients PCA score plots in ESI+（A） and ESI?（B） modes，respectively；OPLS－DA score plots in ESI+（C） and ESI?（D） modes，respectively；OPLS－DA corresponding permutation tests in ESI+（E） and ESI?（F） modes，respectively

2.3 差異代謝物的篩選及其判別效能評價

根據兩組間的倍數變化和差異分析統計值，以倍數變化> 1.50或< 0.67，且P< 0.05為標準并結合VIP > 1.00篩選組間的差異代謝物，共確定66種差異代謝物。其中，甘油磷脂、脂肪酸、鞘磷脂、類固醇、氨基酸、膽堿、核苷的數量構成比例分別為40.91%、28.79%、10.61%、7.58%、7.57%、1.51%、3.03%（圖2）。甘油磷脂和脂肪酸的占比最大，總構成比高達69.70%，表明兩者所涉及的代謝紊亂可能與CA惡性轉變為CRC有關。

圖2 不同類別組間差異代謝物的構成分布Fig.2 Component distribution of differential metabolites between CA and CRC groups

同時，采用ROC分析評估上述66種差異代謝物對CA和CRC的辨別能力，計算AUC值后選擇最合適的截止點，優化每種差異代謝物的靈敏度和特異性。在ROC分析前，對代謝組數據進行QC歸一化處理，以有效降低個體差異和系統誤差的影響。通過差異代謝物的AUC值評估其作為生物標志物對CA與CRC的判別效能，共確定11種對CA與CRC具有良好鑒別能力的差異代謝物作為潛在的生物標志物（AUC > 0.800）。其中，ESI+模式下有7種代謝物，ESI?模式下有4種代謝物。腺嘌呤的AUC值高達0.952，而乙酰肉堿20∶1（ACar 20∶1）的AUC值為0.801。基于ROC分析，進一步探討這些潛在生物標志物在組間的水平變化趨勢。如表1所示，與CA組相比，其中10種差異代謝物在CRC組血清中均呈顯著上調趨勢，大部分為甘油磷脂與脂肪酸類代謝物，說明甘油磷脂和脂肪酸的代謝水平上調可能參與CA的癌變過程。最后根據精確分子量和碎裂離子信息，利用儀器自帶數據庫和HMDB數據庫對上述11種差異代謝物的結構進行初步鑒定，結果顯示匹配效果良好（圖3）。

圖3 高判別效能差異代謝物的鑒定效果Fig.3 Identification effect of differential metabolites with high discriminant ability for the CA and CRC patients

表1 CA與CRC患者的血清生物標志物Table 1 Serum biomarkers for the discrimination between CA and CRC patients

2.4 差異代謝物的多元ROC分析及代謝通路分析

根據MetaboAnalyst 5.0軟件，采用基于支持向量機（SVM）算法的多元ROC分析自動選擇最佳代謝物組合。如圖4所示，11種組間差異代謝物是主要的選擇與考察變量，利用多元ROC分析的AUC值評價其在區分CA和CRC方面的判別效能。圖4B為由圖4A中的前2、3、5、7、10和11種差異代謝物構建的分類模型的ROC曲線及其AUC值。結果顯示，最佳的潛在生物標志物是由前5種差異代謝物組成的標志物組合（AUC = 0.941，95% CI = 0.901 ~ 0.987），其AUC值大于大部分單個差異代謝物的AUC值（圖4B）。因此，前5種差異代謝物的組合可作為CA癌變成CRC的潛在判別標志物。

使用MetaboAnalyst 5.0對上述鑒定的66種差異代謝物進行代謝物富集分析及通路分析，以初步探索與CA癌變相關的代謝通路機制。富集分析結果如圖4C所示，根據P< 0.05篩選出不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝、嘌呤代謝途徑是影響CA惡變為CRC的關鍵代謝途徑。通路分析結果如圖4D所示，以影響因子（IF） > 0.1或P< 0.05為標準確定與CA惡性轉化關聯緊密的代謝通路，可以明顯看出不飽和脂肪酸的生物合成、嘌呤代謝和亞油酸代謝是影響CA癌變轉化的關鍵代謝通路。綜合代謝物富集與通路分析結果可得，上述3條代謝通路的紊亂可能與CA惡性轉化密切相關。

圖4 差異代謝物的多元ROC 分析與代謝通路分析Fig.4 Multivariate ROC analysis and metabolic pathway analysis by differential metabolites between CA and CRC groups

2.5 討 論

近年來，大部分研究致力于探索CRC的潛在診斷生物標志物，但目前尚無通過血清代謝組學研究用于判別CA與CRC患者以輔助CRC早期診斷的可靠生物標志物［15］。Gumpenberger等［16］通過血漿代謝

組學研究發現，在CA和CRC之間有48種差異代謝物，主要包括溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿。在本研究中，磷脂酰膽堿同樣被鑒定為主要的差異代謝物，其在兩組差異代謝物中數量占比最大，同時在多元ROC分析中的判別性能最高的代謝物組合中包括3種磷脂酰膽堿（PC36∶3、PC18∶0、PC20∶4）。除了磷脂酰膽堿外，本研究還發現脂肪酸也是區分CRC與CA的重要潛在生物標志物。通常來說，癌細胞中高表達脂肪酸，以滿足其快速增殖對上調合成、信號轉導和細胞膜形成所需的能量需求。Zhou等［17］的血清脂質組學研究中，4種脂肪酸（棕櫚酸、二十二碳六烯酸、4-十二烷基苯磺酸、15Z-9，12，13-三羥基-15-十八碳烯酸）也被確定為對CA具有良好診斷性能（AUC > 0.80）的潛在脂質標志物。

一般情況下，CA轉化為CRC的過程通常受到多條代謝通路的影響。Mokhtari等［18］對不飽和脂肪酸的生物合成與CRC進展相關的機制進行了研究，與正常組相比，CRC組中基于GEO和TCGA數據庫分析的不飽和脂肪酸生物合成途徑的基因數量顯著增加，包括ELOVL5、TECR、HSD17B112和FADS2基因等，表明了不飽和脂肪酸代謝與CRC發生發展的相關性。同樣，本研究也發現相較于CA組，CRC中的脂肪酸含量明顯增加，且通過代謝物通路及富集分析發現不飽和脂肪酸代謝通路的失調與CA的癌變密切相關。此外，有研究分析了CRC大鼠模型的糞便和血漿樣本，發現相較于正常組，CRC組樣本中的亞油酸含量顯著升高，表明亞油酸代謝的紊亂是CRC大鼠模型的重要代謝特征［19］。相似地，本文的研究結果也顯示亞油酸水平在CRC階段顯著增加，表明亞油酸代謝的上調對腺瘤－癌途徑的發展進程有促進作用。腫瘤細胞不受控制的無限增殖是癌癥形成的主要標志，而腫瘤細胞中嘌呤代謝物呈現顯著上調，嘌呤通過各種受體亞型在細胞免疫反應和細胞因子釋放中充當有效的調節劑，在很大程度上參與腫瘤的產生［20］。本研究也發現嘌呤代謝紊亂與CA的惡化密切相關，且腺嘌呤對CA和CRC具有最高的判別效能而作為潛在生物標志物。然而，上述論證聚焦于通過對CRC組與正常組的比較來探討影響癌癥產生的代謝機制，在本研究中，基于CA與CRC患者血清差異代謝物的富集和通路分析發現，不飽和脂肪酸、嘌呤代謝以及亞油酸代謝通路的紊亂不僅如文獻報道所述與CRC的發生有關，同時也與CA癌變的潛在機制有關。

綜上所述，本研究系統揭示了CA與CRC的血清代謝譜差異，發現11種差異代謝物對兩組患者表現出良好的鑒別效能，可作為潛在生物標志物。特別是其中5種差異代謝物（PC36∶3、腺嘌呤、鞘氨醇、PC18∶0、PC20∶4）組成的代謝物組合可以作為鑒別CA與CRC的潛在生物標志物。此外，還發現不飽和脂肪酸的生物合成、嘌呤代謝和亞油酸代謝的紊亂可能與CA惡性轉化密切相關。本研究結果為進一步揭示結直腸腺瘤－癌途徑在CRC發生發展過程中的潛在作用機制提供了參考。

3 結 論

CRC的早期篩查與治療是降低其發病率和死亡率的有效途徑，代謝組學技術在腫瘤早期篩查中表現出巨大的應用潛力。本文利用高通量和高靈敏度的UHPLC－HRMS技術對CA與CRC患者的血清樣本進行代謝組學分析，系統揭示了兩者的代謝輪廓存在明顯差異，其中，甘油磷脂和脂肪酸是主要差異代謝物，表明其代謝紊亂可能參與CA的癌變過程。此外，5種差異代謝物的組合（包括PC36∶3、腺嘌呤、鞘氨醇、PC18∶0、PC20∶4）在區分CA和CRC方面表現了出色的判別效能，可作為潛在的判別標志物。總體上，本研究為深入研究CA與CRC的血清代謝特征差異以及CA的癌變代謝機制提供了基礎數據，同時也對兩者的臨床鑒別和CRC的早期診斷具有較高的參考意義。由于臨床樣本和動物模型的限制，本研究的相關發現仍需進一步實驗驗證。